В последние 10–15 лет среди всех инфекционных и инвазионных болезней отчетливую тенденцию к росту имеют заболевания, вызванные «нетрадиционными» возбудителями бактериальной, вирусной и протозойной природы, среди которых важное место занимает криптоспоридиоз. Криптоспоридии – важные и широко распространенные агенты, вызывающие желудочно-кишечные заболевания у животных и людей.
Широкое распространение данного заболевания связано с большим количеством природных резервуаров инфекции, низкой инфицирующей дозой и высокой резистентностью возбудителя к дезинфектантам и противопаразитарным препаратам.
По данным [5, 6] 37 % болезней вызывает неблагоприятная экологическая обстановка, влияющая на общую заболеваемость не только животных, но и у людей.
Территория Республики Мордовия характеризуется высоким техногенным загрязнением окружающей среды особенно после катастрофы на чернобыльской АЭС. Различные токсиканты, попадая в организм животного, вызывают задержку его роста и развития, приводя к проявлению иммунодефицитных состояний, возникновению различных заболеваний, а криптоспоридии вызывают тяжелую патологию при дисбалансе иммунитета у хозяина и отягощают общее течение болезни [7].
По имеющимся данным международной ветеринарной статистики криптоспоридиоз среди молодняка животных наносит большой экономический ущерб во многих странах мира. Интенсивность инвазии по нашим данным даже в условиях одной республики достигает от 0,1 до 52,3 % у поросят и от 0,1 до 96,3 % у телят.
Однако, несмотря на некоторые успехи, достигнутые в изучении криптсопоридиоза и его возбудителя, он продолжает оставаться далеко не решенной проблемой.
Однако ряд вопросов, связанных с рассматриваемым заболеванием, изучен недостаточно глубоко и требует дальнейших исследований. До настоящего времени пока не представляется возможности профилактики криптоспоридиоза молодняка сельскохозяйственных животных, нет надежных лечебных средств.
Проблема успешной борьбы с болезнями протозоозами в том числе с криптоспоридиозом не может быть решена без всестороннего изучения патогенеза болезни, ультраструктурной и морфофункциональной организации [3].
Так как сведения о жизненном цикле криптоспоридий были получены преимущественно на культурах клеток [1, 2, 4].
Особенно слабо изучены и отсутствуют данные по ультраструктурной организации возбудителя криптоспоридиоза поросят, которая определила цель и задачу наших исследований.
С целью изучения особенностей процесса развития стадий жизненного цикла Cryptosporidium parvum на модели экспериментально инвазированных поросят крупно-белой породы 3-дневного возраста массой 1,0 – 1,5 кг и его связь со способом инокуляции возбудителя перорально или интратрахеально, обследовали неблагополучные по криптоспоридиозу свиноводства республики Мордовия, Татарстана и Ульяновской области для получения исходного экспериментального материала. Экспериментальный материал ооцист криптоспоридий получали от павших или от больных с выраженным симптомо-комплексом болезни криптоспоридиоза. Всего было вскрыто и исследовано 265 поросят в возрасте от 1–10-дневного возраста живой массой 3,0 – 5,5 кг. Для постановки диагноза на криптоспоридиоз использовали метод окраски мазков из фекалий больных животных стандартным методом – карболовым фуксином по Циль-Нильсену или по Романовскому-Гимзе и соскобов со слизистой оболочки кишечника подвергнутых убою поросят.
Для накопления ооцист криптоспоридий, которые были необходимы для эксперимента, использовали флотационные методы, применяемые в паразитологии.
В качестве флотационных растворов отдавали преимущество тем, которые позволяли получать наибольшее количество биомассы – ооцист возбудителя. Исходный материал, максимально богатый ооцистами, предпочитали получать непосредственно из прямой кишки спонтанно инвазированных животных. Из флотационных растворов мы использовали смесь Бреза, состоящую из сульфата магния и тиосульфата натрия (плотность раствора 1,25–1,3 мг/см3), насыщенных растворов гипосульфита и поваренной соли, которые заранее готовили, а затем смешивали (плотность раствора 1,3 мг/см3), а также раствор сахарозы (плотность 1,25 мг/см3). Преимущество последнего раствора перед другими в том, что он является наиболее щадящим по отношению к ооцистам. Ооцисты не подвергались разрушению в течение суток и более, находясь в растворе сахарозы. Взвесь ооцист практически не содержала сопутствующей микрофлоры и дебриса. Методом центрифугирования полученный изолят ооцист отмывали в 10-кратном объеме воды из флотационного раствора (3 тыс. об/мин в течение 10 мин). Полученную биомассу ооцист криптоспоридий сохраняли с добавлением гентамицина или в 2 % растворе бихромата калия в холодильнике при температуре 4-6 °С. Плотность флотационного раствора подтверждалась показанием ареометра.
Для экспериментов по изучению особенности процесса развития стадий жизненного цикла Cryptosporidium parvum и его связи со способом инокуляции возбудителя и изучения ультраструктурной организации использовали 90 одно-, двухсуточных поросят крупно-белой породы, которым иннокулировали 2 тыс. ооцист крипстопоридий на 1 кг массы тела перорально. Убивали экспериментальных поросят, начиная через 12 часов после заражения, затем каждые 24 часа до 30 дней после заражения.
Исследования проводили методом сканирующей и трансмиссивной электронной микроскопии. Для исследования использовали заметно гиперемированные участки тонкого отдела кишечника.
Для сканирующей электронной микроскопии образы пораженной ткани после фиксации трижды промывали в 0,1м какодилатном буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. Затем, после высушивания, образцы помещали на столик с тонким слоем специального клея, напыляли золотом в вакуумном испарителе JEE -5C. Исследования экспериментальных образцов проводили под сканирующим устройством электронного микроскопа JEM 100 CX (Япония).
Для трансмиссивного электронного микроскопа образцы закрепляли в эпоксидной смоле, контрастировали насыщенным раствором уронилацетата. Дополнительное окрашивание срезов проводили цитратом свинца.
Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LCB-V и исследовали в электронном микроскопе JEM -10 CX (Япония).
При исследовании экспериментальных образцов методов сканирующей электронной микроскопии на поверхности 12-ти перстной, тощей и подвздошных отделов кишечника обнаруживали многочисленных развившихся паразитов. Особенно развившихся паразитов было много в подвздошном отделе кишечника. Все развившиеся стадии находились в зоне щеточной каемки энтероцитов. Они не были внедрены в клетку хозяина, а находились в контакте с энтероцитами, у основания микроворсинок, образуя электронно-плотную мембрану, которая служит для паразита питающейся органеллой. В процессе развития эндогенные стадии криптоспоридий находились внутри паразитоформной вакуоли, которая, окружая паразитическую клетку, представлялась в виде ореола, что обычно позволяло легко идентифицировать паразита на электроннограммах.
При электронно-микроскопическом исследовании уже через 18 часов после заражения поросят Cryptosporidium parvum наблюдали трофозоиты с крупным ядром, окруженным ядерной оболочкой. В процессе дальнейшего развития ядро претерпевает несколько последовательных делений, в результате которых образуются мерозоиты, формируя меронты.
Мерогония или бесполое размножение у C. parvum повторяется. Меронты I типа выявлялись со сформированными 6 – 8 мерозоитами, которые способны к циклическому развитию, а меронты II типа имели 4 мерозоита. Меронты I типа повторялись, а II типа давали начало половому развитию паразита макро- и микрогамонтам, которые развивались в микро- и макрогаметы. Процесс формирования ооцист C. parvum, включая и спорулированных у экспериментально зараженных поросят, наблюдали на 5 сутки после заражения. На 8 сутки число ооцист значительно увеличивалось, что совпадало с пиком выделения возбудителя во внешнюю среду.
Таким образом, на электроннограммах экспериментального материала в период исследования были обнаружены все стадии жизненного цикла криптоспоридий: трофозоиты, меронты, макро- и микрогамонты, зиготы и ооцисты.
Паразиты находились в зоне щеточной каемки, в контакте с энтероцитами у основания микроворсинок, образуя электронно-плотную мембрану (зону прикрепления).