Эффективность использования препаратов в сверхмалых дозах (СМД) к настоящему времени уже доказана. Об этом говорят как большое количество работ по действию фармакологических препаратов в сверхмалых дозах (СМД) [1-4, 8, 11, 12, 14, 15]. К сверхмалым дозам лекарственных препаратов относят те, концентрации которых на один или несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества с эффектором. В одном моле вещества около 6∙1023 молекул, а число клеток в любом многоклеточном организме (например, животного) по порядку величины составляет примерно 1010, так что приведении биологически-активных веществ (или других препаратов) в дозах 10-12 – 10 -13 М на одну клетку приходится от 10 до 1-й молекулы ксенобиотика. Поэтому СМД отвечают концентрации 10-12 М и ниже (Бурлакова Е.Б. и др.[2,10]). Таким образом, концентрации сверхмалых доз колеблются в пределах 10-12 – 10-24 М. Одним из наиболее интригующих свойств действия препаратов в СМД является отсутствие их эффекта в промежутке от 10-8 – 10-12 М. В научной литературе этот коридор был назван «мертвой» или «молчащей» зоной. Сам эффект доказан, а что является «пускателем» или триггером входа в нее и фактором, отменяющим дезактивацию препаратов в СМД до сих пор неизвестно.
Безусловно положительным фактом влияния препаратов в СМД является наличие фармакологического эффекта, соизмеримого с таковым в средне- терапевтических дозах при отсутствии побочных эффектов данного препарата. Негативной стороной возможного применения препаратов в СМД является отсутствие исследований фармакокинетических исследований, механизма действия, объясняющего все эффекты СМД, и понятных критериев контроля действия фармакологических средств в СМД. В наших предыдущих работах мы предложили использовать изменение уровня жирных кислот в фосфолипидах мембран и межклеточного вещества под действием разных препаратов в разных СМД [5, 6].
Целью работы был анализ возможности использования уровней жирных кислот как триггер – факторов входа и выхода из «мертвой» зоны при воздействии препаратов в СМД.
Материалы и методы: изучение уровня жирных кислот (ЖК) в мембранах сердца, печени и почек, а также в межклеточном веществе и цитоплазме у крыс с экспериментальным миокардитом. Изучение уровня жирных кислот производилось с помощью газового хроматографа Agilent 6080. Газ-носитель – водород. Расчеты концентрации ЖК производились с помощью программы Chemstation. Экспериментальный миокардит вызывался с помощью цитокинового шторма. Диклофенак вводился в концентрации 2,3*10-8 М (СМД-0) в концентрации 2,3*10-12 М (СМД-1) и в концентрации 2,3*10-13 М (СМД-2) вводились парентерально. Растворителем препарата бы хлористый натрий 0,9 % (физиологический раствор).
Результаты исследования и их обсуждение
В концентрации 3,2* 10-8 М – 2,3*10-12 М действие любого ксенобиотика не выявлено. Но факторами, запускающими вход в «мертвую зону» и выход из нее пока не известен. Понятно одно, здесь неэффективен рецепторный механизм действия. Единственным объяснением воздействия СМД может быть их действие через межклеточное вещество. Мы попытались доказать этот [7, 9].
Вопрос в одном: что первично – изменение качественного и количественного состава жирных кислот в фосфолипидах мембран, а также, в межклеточном веществе и цитоплазме клеток (в нашем случае – сердца, печени и почек) или сначала идет воздействие ксенобиотиков на межклеточное вещество, а оно изменяет уровень ЖК в фосфолипидах мембран и межклеточном веществе.
Итак, рассмотрим концентрацию 2,3*10-8 М в мембранах кардиомиоцитов. Обнаружено, что некоторые ЖК находятся в одинаковых концентрациях (табл. 1). Так, Петроселиниковая и 9-Октадекановая кислоты были в попарно близких концентрациях (в пределах средне-квадратичной ошибки). Кроме того, Докозагексаеновая и Линоленовая кислоты также были попарно равными. Такая же картина наблюдалась и при воздействии диклофенака в СМД, равной 2,3*10-12 М. Однако, в этом случае одинаковые концентрации были у 9-Октадекановой и Миристолеиновой кислот, а также у Эйкозатетраеновой и Докозагексаеновой кислот.
При сравнении воздействия диклофенака в двух СМД (2,3*10-8М и 2,3*10-12М) наблюдались также попарно – равные концентрации: это были Миристолеиновая и Эйкозатетраеновая и Докозагексаеновая кислоты. При этом, Миристолеиновая кислота была равна как для мембран и межклеточного вещества в СМД, равном 2,3*10-8М (см. табл. 1). Можно предположить, что попарно-равные концентрации являются триггер – факторами, меняющими фосфолипиды мембран так, что они меняют свои свойства таким образом, что фармакологическое воздействие диклофенака не проявляется.
При изучении влияния диклофенака в межклеточном веществе и цитоплазме кардиомиоцитов попарно – равных концентраций ЖК не было обнаружено в СМД, равном 2,3*10-8М.
При изучении влияния диклофенака в СМД, равном 2,3*10-13М в мембранах (т.е. вне «мертвой» зоны) равных концентраций жирных кислот ни между собой, ни с ЖК под воздействием СМД, равном 2,3*10-8М и 2,3*10-12М не наблюдалось.
Таблица 1
Изменение количественного состава ЖК в тканях сердца под действием диклофенака в сверхмалых дозах
|
Жирная кислота |
КОНЦЕНТРАЦИЯ ДИКЛОФЕНАКА |
|||||
|
2,3*10-8М |
2,3*10-12М |
2,3*10-13М |
||||
|
Мембран |
МКВиЦК* |
Мембран |
МКВиЦК* |
Мембран |
МКВиЦК* |
|
|
PETROSELINIC |
4,32 ± 0,45 |
7,11 ± 0,719 |
1,32 ± 0,11 |
8,3 ± 0,82 |
4,41 ± 0,44 |
2,19 ± 0,22 |
|
9-OCTADECANOIC |
4,26 ± 0,39 |
4,18 ± 0,42 |
0,81 ± 0,09 |
4,48 ± 0,47 |
4,91 ± 0,5 |
2,96 ± 0,31 |
|
MYRISTOLEIC |
2,22 ± 0,24 |
2,12 ± 0,22 |
0,83 ± 0,08 |
-* |
48,32 ± 4,92 |
2,39 ± 0,23 |
|
EICOSATETRAENIC |
13,65 ± 1,4 |
15,63 ± 1,54 |
2,2 ± 0,23 |
28,88 ± 3,0 |
36,66 ± 3,58 |
23,31 ± 2,34 |
|
DOCOSAHEXENOIC |
2,1 ± 0,25 |
8,57 ± 0,856 |
2,22 ± 0,23 |
10,69 ± 1,05 |
0,37 ± 0,045 |
8,15 ± 0,84 |
|
LINOLEIC |
4,69 ± 0,51 |
3,99 ± 0,41 |
7,21 ± 0,75 |
-* |
-* |
6,04 ± 0,61 |
|
LINOLENIC |
2,08 ± 0,21 |
19,61 ± 2,01 |
3,42 ± 0,31 |
6,41 ± 0,59 |
2,18 ± 0,22 |
29,23 ± 2,9 |
Примечание. * – межклеточное вещество и цитоплазма клетки.
Таблица 2
Изменение количественного состава ЖК в тканях печени под действием диклофенака в сверхмалых дозах
|
Жирная кислота |
КОНЦЕНТРАЦИЯ ДИКЛОФЕНАКА |
|||||
|
2,3*10-88М |
2,3*10-12М |
2,3*10-13М |
||||
|
Мембраны |
МКВиЦК* |
Мембраны |
МКВиЦК* |
Мембраны |
МКВиЦК* |
|
|
PETROSELINIC |
3,86 ± 0,4 |
2,65 ± 0,3 |
2,45 ± 0,25 |
3,59 ± 0,36 |
5,49 ± 0,55 |
1,86 ± 0,19 |
|
9-OCTADECANOIC |
2,35 ± 0,22 |
3,1 ± 0,32 |
2,78 ± 0,27 |
4,1 ± 0,41 |
2,96 ± 0,3 |
1,9 ± 0.19 |
|
MYRISTOLEIC |
0,44 ± 0,045 |
0,42 ± 0,04 |
0,59 ± 0,06 |
0,42 ± 0,04 |
0,37 ± 0,04 |
0,44 ± 0,04 |
|
EICOSATETRAENIC |
11,39 ± 1,14 |
8,47 ± 0,85 |
16,48 ± 1,7 |
12,51 ± ,25 |
9,75 ± 0,98 |
5,55 ± 0,56 |
|
DOCOSAHEXAENOIC |
3,11 ± 0,31 |
7,37 ± 0,74 |
2,51 ± 0,26 |
13,25 ± ,33 |
4,19 ± 0,42 |
10,24 ± 1,03 |
|
LINOLEIC |
4,13 ± 0,414 |
3,02 ± 0,3 |
0,47 ± 0,05 |
8,27 ± 0,83 |
0,41 ± 0,04 |
4,33 ± 0,44 |
|
LINOLENIC |
6,37 ± 0,64 |
8,59 ± 0,9 |
2,96 ± 0.3 |
1,41 ± 0,14 |
8,02 ± 0,8 |
2,49 ± 0.25 |
Примечание. * – межклеточное вещество и цитоплазма клетки.
Таблица 3
Изменение количественного состава ЖК в тканях почек под действием диклофенака в сверхмалых дозах
|
Жирная кислота |
КОНЦЕНТРАЦИЯ ДИКЛОФЕНАКА |
|||||
|
2,3*10-88М |
2,3*10-12М |
2,3*10-13М |
||||
|
Мембран |
МКВиЦК* |
Мембран |
МКВиЦК* |
Мембран |
МКВиЦК* |
|
|
PETROSELINIC |
3,52 ± 0.35 |
4,84 ± 0,48 |
2,15 ± 0,22 |
4,45 ± 0.45 |
7,25 ± 0,73 |
3,85 ± 0,39 |
|
9-OCTADECANOIC |
3,39 ± 0,34 |
4,45 ± 0,45 |
5,06 ± 0,5 |
4,66 ± 0.47 |
4,45 ± 0,45 |
0,69 ± 0.07 |
|
MYRISTOLEIC |
0,49 ± 0,05 |
1,17 ± 0,12 |
0,16 ± 0,02 |
0,95 ± 0,09 |
0,43 ± 0,04 |
0,76 ± 0,08 |
|
EICOSATETRAENIC |
17,02 ± 1.7 |
15,01 ± 1,5 |
14,88 ± 1,5 |
17,60 ± 1,77 |
31,63 ± 3.2 |
27,96 ± 2,8 |
|
DOCOSAHEXAENOIC |
1,92 ± 0,19 |
9,31 ± 0,93 |
2,77 ± 0,3 |
12,49 ± 1,25 |
2,39 ± 0,24 |
10,68 ± 1,07 |
|
LINOLEIC |
5,65 ± 0,6 |
2,78 ± 0,28 |
1,65 ± 0,17 |
0,05 ± 0,006 |
15,67 ± 1.6 |
5,99 ± 0,6 |
|
LINOLENIC |
5,72 ± 0,57 |
9,55 ± 0,96 |
0,87 ± 0,09 |
4,41 ± 0,45 |
13,92 ± 1.4 |
1,33 ± 0.14 |
Примечание. * – межклеточное вещество и цитоплазма клетки.
Таким образом, можно сделать предварительный вывод, что изменения в уровне ЖК кардиомиоцитов и в их межклеточном веществе и цитоплазме могут быть маркерами начала и конца «мертвой» зоны в сердце крыс с экспериментальным миокардитом. При этом, начало «молчащей» зоны сопровождается большим количеством ЖК, имеющих попарно – равные концентрации.
При исследовании воздействия диклофенака в тех же СМД на клетки печени (табл. 2) наблюдалась несколько иная картина. В мембранах гепатоцитов, как и в межклеточном веществе и цитоплазме не было попарно-равных концентраций жирных кислот при воздействии диклофенака в СМД, равной 2,3*10-8М. Однако, при сравнении наличия попарно-равных концентраций ЖК в мембранах и межклеточном веществе и цитоплазме наблюдалась таковая для Докозагексаеновой и 9 – Октадекановой кислот. Кроме того, наблюдались близкие концентрации ЖК для Миристолеиновой кислоты в мембране и межклеточном веществе.
Однако, при сравнении ЖК мембран и межклеточного вещества и цитоплазмы гепатоцитов при воздействии диклофенака в СМД, равном 2,3*10-8 и 2,3*10-12М наблюдалась близкие концентрации Линолевой и 9 –Октадекановой кислот. В то же время, наблюдались попарно – равные концентрации для Миристолеиновой кислоты в межклеточном веществе и цитоплазме гепатоцитов.
Изучение концентрации ЖК в межклеточном веществе и цитоплазме гепатоцитов показало, что попарно – равная концентрация наблюдалась для Миристолеиновой кислоты в СМД, равной как 2,3*10-8М, так и 2,3*10-12М.
При анализе воздействия диклофенака в СМД, равной 2,3*10-13М как в мембранах, так и в межклеточном веществе и цитоплазме тканей печени попарно – равных концентраций ЖК не наблюдалось. При сравнении воздействия диклофенака в разных СМД наблюдалась попарно – равная концентрация Миристолеиновой кислоты при СМД, равном 2,3*10-8М и 2,3*10-12М в межклеточном веществе и цитоплазме гепатоцитов, а также той же кислоты в СМД, равной 2,3*10-8М и 2,3*10-13М в межклеточном веществе и цитоплазме. Кроме того, воздействие диклофенака в СМД, равной 2,3*10-8М наблюдались попарно – равная концентрация Миристолеиновой кислоты в мембране и в 2,3*10-13М в межклеточном веществе и цитоплазме гепатоцитов.
Таким образом, наблюдается два странных факта: во-первых, появляется попарное равенство уровня Миристолеиновой кислоты в СМД, равном 2,3*10-13М. Во – вторых, проявляется равенство Миристолеиновой кислоты как в фосфолипидах мембраны гепатоцитов в СМД, равном 2,3*10-8М, так и в межклеточном веществе во всех трех СМД. Самый интригующий факт заключается в том, что появилось попарно – равная концентрация Миристолеиновой кислоты в СМД, равном 2,3*10-13М, т.е. вне «мертвой» зоны.
При анализе влияния диклофенака в СМД в мембранах клеток почек не наблюдается попарно – равные концентрации ЖК в концентрациях 2,3*10-8М и 2,3*10-12М, а также 2,3*10-13М. Иная картина просматривается при сравнении уровня ЖК в мембранах и в межклеточном веществе и цитоплазме почек (табл. 3).
При сравнении СМД 2,3*10-8М и 2,3* *10-12М были обнаружены попарно – равные концентрации 9- октадекановой – Петроселиниковой кислот в межклеточном веществе и цитоплазме. Та же ЖК попарно-равна таковой в фосфолипидах мембран клеток при воздействии диклофенака в СМД, равной 2.3*10-13М. Других попарно – равных концентраций ЖК при воздействии диклофенака в 2,3*10-12 М и 2,3*10-13М обнаружено не было.
Таким образом, в тканях почек попарно – равные концентрации в переходе в «мертвую» зону были 9 – Октадекановой и Петроселиниковой кислот. Это полностью органоспецифическая реакция, т.к. ни в сердце, ни в печени попарно – равных концентраций нет.
Как ранее говорилось, целью работы был анализ возможности использования ЖК как маркеров входа и выхода в «мертвую» зону под действием ксенобиотиков в СМД. Для этого необходимо ответить на следующие вопросы:
1. Что первично – изменение качественного и количественного состава ЖК как в мембранах, так и в межклеточном веществе или сначала идет воздействие ксенобиотиков в СМД и как следствие, изменение уровня ЖК?
Ответ на этот вопрос может быть получен при сравнении уровней ЖК у интактных животных или у животных с экспериментальной патологией без введения препарата. В исследуемом случае, при экспериментальном миокардите, мы сравнивали уровни ЖК при экспериментальном миокардите и при миокардите, но под действием диклофенака в СМД 0,1,2. Анализ показал, что при экспериментальном миокардите не наблюдалось попарно-равных концентраций ЖК, в то время как при воздействии диклофенака в СМД, равном 0.1,2 они присутствовали. Следовательно, эффект попарно – равных концентраций ЖК вызывается препаратами в СМД.
1. Существует ли органоспецифическое действие препаратов в СМД на попарно – равные концентрации ЖК?
Мы обнаружили существование попарно – равные концентрации отдельных ЖК в разных органах (например, сердце – печень). Однако, трактовать этот эффект как влияние диклофенака в СМД 0,1,2 или взаимное влияние ЖК друг на друга под действием препарата в СМД мы не рискнули. Органы расположены не компактно, поэтому их влияние друг на друга или общее воздействие диклофенака сомнительно. Конечно, если предположить, что препараты в СМД имеют резонансную природу действия на ткани организма, то тогда и наши данные могут объяснить взаимное попарно – равное содержание ЖК. Данная теза требует более глубоких и серьезных исследований. Поэтому обсуждать данную гипотезу пока не представляется возможным.
2. Может ли попарно – равная концентрация ЖК быть триггер – фактором входа в «мертвую» зону под действием диклофенака в СМД, равном 2,3*10-8М?
Исходя из вышеперечисленных фактов, ответ на данный вопрос мы разнесем по отдельным органам. Как было показано выше, в тканях сердца наблюдаются попарно – равные концентрации, а также близкие к таковым в фосфолипидах мембран при отсутствии их в СМД, равном 2,3*10-8М, а также в мембранах кардиомиоцитов в СМД, равном 2,3*10-12М. При этом, ни в первой СМД (СМД-0), ни во второй СМД (СМД-1), в межклеточном веществе, не наблюдались попарно – равные концентрации ЖК. Однако, при сравнении концентраций ЖК в мембранах и в межклеточном веществе попарно – равные концентрации наблюдались между концентрациями ЖК в мембранах и межклеточном веществе. Более того, на границе «мертвой» зоны это были Миристолеиновая – Эйкозатетраеновая – Докозагексаеновая кислоты. Кроме того, ни в какой другой СМД (ни в 2,3*10-12М – мембраны – межклеточное вещество, ни в СМД, равной 2,3*10-13М) таких попарно – равных концентраций не наблюдалось. Следовательно, появление в мембранах попарно – равных концентраций данных ЖК и появление попарно – равной концентрации Эйкозатетраеновой и Докозагексаеновой кислот в мембранах при воздействии диклофенака в СМД, равной 2,3*10-12М включает режим мертвой зоны, в котором препарат не работает. Для подтверждения данного положения необходимо доказать отсутствие попарно – равных концентраций в СМД, значительно меньших, чем «нижний порог» концентраций «мертвой зоны». В наших исследованиях это была близкая СМД к данной зоне – 2,3*10-13М. Как показано в табл. 1, попарно – равных концентраций в мембранах и в межклеточном веществе и цитоплазме в СМД, равной 2,3*10-13М нет. Конечно, динамические процессы в данной СМД продолжаются и при сравнении с 2,3*10-12М в межклеточном веществе еще наблюдаются: попарно – равные концентрации, например, 9 – Октадекановая, Докозагексаеновая и Линоленовая кислоты. Но и СМД лишь на порядок ниже «мертвой» зоны.
В тканях печени развивается несколько иная динамика изменений концентраций ЖК (табл. 2). В фосфолипидах мембран и в межклеточном веществе и цитоплазме печени попарно – равных концентраций жирных кислот не наблюдалось ни при воздействии диклофенака в СМД, равных 2,3*10-8, ни в 2,3*10-12М. Другая картина наблюдалась при сравнении концентраций под действием диклофенака в СМД, равной, 2,3*10-8М и 2,3*10-12М. Появились попарно – равные концентрации Миристолеиновой кислоты, а также наблюдались близкие концентрации Линолевой и 9 – Октадекановой кислот. Таким образом, можно предположить, что переход в «мертвую» зону имеет общую с тканями сердца попарно – равные концентрации (Миристолеиновая и Докозагексаеновая кислоты). Подтверждением служит отсутствие попарно – равных концентраций ЖК в фосфолипидах мембран и межклеточного вещества и цитоплазме под действием диклофенака в СМД, равной 2,3*10-13М.
И, наконец, в тканях почек были следующие изменения (табл. 3). Как и в тканях сердца и печени, мы не наблюдали попарно – равных концентраций ЖК ни в фосфолипидах мембран клеток почек, ни в их межклеточном веществе в зоне перехода в «мертвую» зону (2,3*10-8М). При сравнении с СМД самой «мертвой» зоны (2,3*10-12М), можно констатировать, что попарно – равные концентрации наблюдались для 9 – Октадекановой и Петроселиниковой кислот (межклеточное вещество и цитоплазма). Это полностью органо – специфичная реакция. Таких равновесных пар не наблюдалось в других органах, но отсутствие эффекта препарата в этих концентрациях говорит о наличии «мертвой» зоны. В СМД, равной 2,3*10-13М, попарно – равных концентраций не наблюдалось. Это подтверждает, что режим «мертвой» зоны в данной СМД отменяется.
Заключая рассуждения о влиянии диклофенака в разных СМД на уровень ЖК и роли сверхмалых доз на вход в «мертвую» зону, можно сделать вывод, что триггер – фактором входа в «мертвую» зону служит попарно – равная концентрация Миристолеиновой, Эйкозатетраеновой и Докозагексаеновой кислот.
Однако, возникает вопрос о выходе из «мертвой» зоны. Для понимания, какой фактор «выводит» из мертвой зоны, нужно сравнить попарно – равные концентрации ЖК в 2,3*10-8М и 2,3*10-12М (или, при необходимости, 2,3*10-13М). Если будут появляться, отличные от концентрации 2,3*10-8М, ЖК в попарно – равных концентрациях, то можно сделать вывод, что появление именно этих кислот и является триггер – фактором выхода из мертвой зоны. Кроме того, равные концентрации ЖК показывают общность механизма входа – выхода из мертвой зоны. Возможно, меняя пространственную структуру фосфолипидов, ЖК в равных концентрациях, меняют пространственную структуру рецепторов и ферментов, выполняющих роль рецепторов (например, ЦОГ-1, 2). В нашем случае, действие препарата в СМД, равной 2,3*10-13М приводит к отсутствию попарно – равных концентраций как в ЖК фосфолипидов мембран и межклеточного вещества и цитоплазмы органов, но и динамические связи между уровнем ЖК (например, 2,3*10-8М, 2,3*10-12М и 2,3*10-13М). Таким образом, отсутствие равных концентраций ЖК является триггер – фактором выхода из «мертвой» зоны.
Обобщая, приведем общую модель воздействия ксенобиотиков в сверхмалых дозах.
Ксенобиотики в СМД = 10-8М поступают в межклеточное пространство клетки и меняют уровень некоторых ЖК в межклеточном веществе. Если возникает ситуация, когда образуются попарно-равные концентрации ЖК или их отдельных представителей, то начинается процесс воздействия на ЖК фосфолипидов мембран (или действуют ксенобиотики в данной концентрации). Если и там образуются попарно – равные концентрации ЖК, то меняются свойства самой мембраны и, как следствие, действие ксенобиотиков в этой концентрации любых ксенобиотиков не происходит («мертвая зона»). В случае, когда в межклеточном веществе есть попарно-равные концентрации, а в мембранах их нет, то действие некоторых веществ (например, медиаторов и некоторых препаратов) продолжается, но в очень малой степени, по отношению к реальной силе того же вещества в средне-терапевтической дозе.
При поступлении ксенобиотиков в СМД = 10-12М принцип сценария тот же самый, что и при начальной дозе «мертвой зоны», но, видимо, под действием ксенобиотика в данной СМД возникает не одна пара равных концентраций ЖК в межклеточном веществе и в мембране (возможно, попарно-равная концентрация одной ЖК как в мембране, так и в межклеточном веществе), а несколько. В таком случае эффект «мертвой зоны» отменяется. При этом, если попарно-равные концентрации ЖК возникают только в межклеточном веществе (или только в мембране), не образуясь в мембране (или, напротив, в мембране), то эффект «мертвой» зоны или не отменяется, или действие препарата весьма незначительно.
При поступлении ксенобиотика в меньших СМД, чем 2,3*10-12М, они разрывают попарно – равную концентрацию ЖК, что восстанавливает функциональную активность межклеточного вещества, а вслед за этим и мембран органов. Как следствие, ответная реакция мембранных рецепторов на данный ксенобиотик.
Выводы
1. Изменение попарных концентраций отдельных жирных кислот под действием препаратов в СМД является триггер – факторами входа и выхода из «мертвой» зоны.
2. Триггер – фактором входа в «мертвую» зону служит попарно – равная концентрация Миристолеиновой, Эйкозатетраеновой и Докозагексаеновой кислот.
3. Отсутствие равных концентраций жирных кислот является триггер – фактором выхода из «мертвой» зоны.