В сформировавшемся и постоянно пополняемом реестре «болезней свободных радикалов» имеются указания на то, что биотрансформация различных веществ чужеродной природы (ксенобиотиков), обладающих токсическим воздействием на клетки организма, происходит с активной генерацией свободнорадикальных субстанций [10]. В тоже время данные литературы свидетельствуют о возникновении состояния окислительного стресса при избыточном поступлении продуктов питания в организм [2], а также о сопряженности дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» с увеличением концентрации различных нормальных, естественных метаболитов в биологических жидкостях и тканях, например: глюкозы крови при сахарном диабете [5], мочевой кислоты при хронической сердечной недостаточности [7], мочевины при моделировании ее влияния на метаболизм при хронической почечной недостаточности [8], этанола при алкогольной интоксикации и алкогольной зависимости [3].
Высокая медико-социальная значимость уровня алкоголизации населения создает необходимость учета всех аспектов развития алкогольной болезни, основным из которых рассматривается биологический аспект. Грубое вмешательство экзогенного этанола в метаболические процессы определяет поиск направлений коррекции многочисленных нарушений обменных процессов.
Важной точкой приложения влияния лекарственных препаратов является функционирование антиоксидантной системы клеток, поражение которой показано при хроническом повреждении гепатоцитов [9], в том числе алкоголь-индуцированных [4]. Оценка синтетических препаратов антиоксидантного действия сохраняется значимой [6].
В связи с этим, целью настоящего исследования была оценка влияния этилметилгидроксипиридина сукцината на уровень восстановленного глутатиона и активность ферментов его обмена при моделировании состояния алкогольной зависимости.
Задачи исследования:
1. Выяснить содержание восстановленного глутатиона в ткани печени лабораторных животных в условиях отмены этанола на фоне воздействия этилметилгидроксипиридина сукцината;
2. Оценить активность глутатионпероксидазы в гомогенатах печени при моделировании алкогольного абстинентного синдрома на фоне применения препарата с действующим веществом – этилметилгидроксипиридин сукцинат;
3. Исследовать ферментативную активность глутатионредуктазы в печеночной ткани алкоголизированных животных с использованием в эксперименте производного этилметилгидроксипиридина.
Материалы и методы исследования
В эксперименте использовали беспородных 105 крыс-самцов массой 180–220 г. Для формирования нарушений обменных процессов, аналогичных при алкогольном абстинентном синдроме, применяли модель экспериментального алкоголизма, разработанную Абдрашитовым А.Х. и соавт. (1987). Согласно этой модели, которая позволяет смоделировать нарушения обмена веществ у крыс независимо от фактора предпочтения алкоголя, учитываемом исследователями [1], животным интрагастрально вводили 25 % раствор этанола в дозе 8 г/кг в сутки в течение 4 дней и 4 г/кг/сут на 5 сутки. Животные подвергались декапитации под эфирным наркозом через 1 (группа А1), 2 (группа А2), 3 (группа А3) суток после заключительного введения алкоголя. Животным контрольной группы проводилось интрагастральное, эквиобъемное введение воды.
Для оценки влияния этилметилгидроксипиридина (препарат «Мексидол», раствор для внутримышечного и внутривенного введений, в ампулах по 2 мл) на показатели антиоксидантной защиты в период реакции отмены этанола были сформированы 3 группы животных, которым внутримышечно вводили «Мексидол» 50 мг/сут в период развития реакции отмены этанола. Выведение животных из эксперимента и измерение показателей проводилось через 1 (группа А1+ М), 2 (группа А2+М 2) и 3 (группа А3+М) суток после последнего введения алкоголя.
Определение уровня восстановленного глутатиона и активности ферментов антиоксидантной системы проводили в гомогенатах печени, для приготовления которых вскрывали брюшную полость, печень перфузировали охлажденным 0,14 М раствором хлорида натрия. После взвешивания ткань гомогенизировали в гомогенизаторе в течение 40 с, используя сахарозную среду выделения, которая содержала 0,25 М сахарозы, 0,001 М ЭДТА (рН 7,4) [38]. Затем гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. при температуре ниже 4оС. Надосадочная жидкость использовалась для определения показателей содержания восстановленного глутатиона, активности глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы
Содержание восстановленного глутатиона в гомогенатах печени определяли по реакции с 5, 5/- дитиобис -2 нитробензойной кислотой методом Sedlak J. et al. (1968) после осаждения белка 0,56 М HClO4. К 1,0 мл безбелкового экстракта добавляли 2,0 мл 0,4 М Трис-буфера и 0,05 мл 5, 5/- дитиобис -2 нитробензойной кислоты. Изменение оптической плотности регистрировали при длине волны 412 нм после 5–ти минутной инкубации против пробы, содержащей 0,5 мл среды выделения, 0,5 мл 0,56 М HClO4, 2,0 мл 0,4 М Трис-буфера и 0,05 мл 5, 5/- дитиобис -2 нитробензойной кислоты.
Определение активности глутатионредуктазы (ГР; КФ 1.6.4.2) по методу Carlberg I. (1985) основано на измерении скорости окисления НАДФН, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм.
В кювету с расстоянием между рабочими гранями 1 см последовательно вносили 2,7 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,0), 0,1 мл 0,1 мМ раствора НАДФН, 0,1 мл гомогената. Реакцию запускали добавлением в реакционную пробу 0,1 мл 0,5 мМ раствора окисленного глутатиона. Смесь перемешивали. Изменение оптической плотности регистрировали через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме окисленного глутатиона и раствора НАДФН. Активность фермента выражали в мкмоль/мин на г белка и в мкмоль/мин на г ткани.
Активность глутатионпероксидазы (ГП; КФ 1.11.1.9) определяли по методу D.E. Paglia et al. (1967) в модификации Д.В. Черданцева (2002). Мерой активности глутатионпероксидазы является скорость окисления восстановленного глутатиона в присутствии пероксида водорода. Концентрацию восстановленного глутатиона до и после инкубации определяют колориметрически. В основе развития цветной лежит взаимодействие SH-групп восстановленного глутатиона с 5,5/-дитио(бис)-нитробензойной кислотой (ДТНБК) с образованием окрашенного продукта-тионитрофенильного аниона. Количество последнего прямо пропорционально количеству SH-групп восстановленного глутатиона, прореагировавших с ДТНБК. 0,2 мл гомогената преинкубируют с 0,73 мл 4,8 мМ раствора групп восстановленного глутатиона в течение 10 минут при 37°С. Реакцию инициировали добавлением 0,07 мл 0,14 % раствора третбутила гидропероксида и инкубировали 5 минут. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл холодной ТХУ. В контрольные пробы третбутил гидропероксид вносили после осаждения белков. Осажденные белки удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона. К 0,1 мл супернатанта добавляли 2,85 мл 0,1М трис-НСI-буфера (рН 8,5) и 0,05 мл реактива Эллмана. Через 5 минут пробы спектрофотометрировали при 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против дистиллированной воды. Активность фермента выражали в мкмоль/мин на мг белка.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью компьютерной программы AnalystSoft Inc., Statplus, версия 5. В качестве основных характеристик описательной статистики применяли медиану (Ме), нижний 25-й (L) и верхний 75-й (Н) квантили (Me; L; H). Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (U).
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе полученных данных обнаружено снижение в печени в 2,3 раза (pU<0,05) уровня восстановленного глутатиона и составило 2,3 (1,6; 2,6) мкмоль/г белка) на 1 сутки синдрома отмены этанола по сравнению с контролем. При оценке активности в этот период глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы статистически значимых различий выявлено не было.
Активность глутатионредуктазы в группе А2 определена на уровне 56,7 (48,3; 60,9) мкмоль/г ткани, что ниже на 17 % (pU<0,05) по сравнению с контролем. Несмотря на это уровень глутатиона в этот срок соответствует значениям группы интактных животных (pU>0,05). Глутатионпероксидазная активность повышена в данной группе животных на 32 % (pU<0,01) по отношению к группе контроля и составляет 19,0 (16,8;20,6) мкмоль/мин/мг белка.
На 3 сутки реакции отмены этанола наблюдается уменьшение концентрации глутатиона на 18 % (pU<0,05) по отношению к значениям контрольной группы. Отличий в активности глутатионредуктазы от значений группы интактных животных не наблюдается (pU >0,05). Глутатион-зависимое восстановление пероксида водорода и различных органических гидропероксидов осуществляется селенсодержащим ферментом – глутатионпероксидазой – активность которого повышена в данной группе животных на 15 % (pU <0,05).
Оценка влияния этилметилгидроксипиридина сукцината на уровень восстановленного глутатиона в 1 сутки реакции отмены этанола выявила, что концентрация этого тиола остается сниженной (на 22 %, pU<0,05) по отношению к контролю, хотя выраженность данного снижения по сравнению с группой А1 уменьшается примерно в 2 раза. Данные события происходят, несмотря на значительное (на 30 %, pU<0,01) увеличение использования восстановленного глутатиона в ходе глутатионпероксидазной реакции. Статистически значимых изменений со стороны глутатионредуктазы не выявлено.
В следующий срок оценки показателей глутатионовой антирадикальной системы (2 сутки отмены этанола) в условиях применения Мексидола содержание восстановленного глутатиона, активность глутатионредуктазы в гомогенатах ткани печени достигает значений контрольной группы и сохраняется высокой глутатионпероксидазная активность (увеличена в 1,1 раза, pU<0,01 по отношению к контролю).
Данные изменения, вероятно, приводят к тому, что значения определяемых показателей на 3 сутки реакции отмены этанола не отличаются от результатов в группе контроля.
Выводы
Важную роль в антирадикальной защите играют низкомолекулярные тиолы – цистеин, метионин, эрготионеин и, особенно, восстановленный глутатион. Основным местом синтеза глутатиона и метаболизма этилового спирта является печень. Дефицит антиоксидантов в печени может быть связан с недостатком восстановленного глутатиона.
Недостаток восстановленного глутатиона обусловлен его использованием глутатионпероксидазой, а также с низкой активностью глутатионредуктазы. Полученные данные свидетельствуют о том, что неэффективность антиокислительной защиты в период развития отмены этанола связана в первую очередь с нарушением обмена глутатиона.
Это обстоятельство побудило нас исследовать возможность коррекции выявленных нарушений, что может быть достигнуто назначением препаратов, обладающих антиоксидантным действием.
Содержание восстановленного глутатиона в гомогенатах печени при использовании Мексидола оставалось сниженным, однако степень этого уменьшения была значительно ниже, чем у животных, не получавших препарат. Влияние Мексидола на активность ферментов обмена глутатиона выражается в предупреждение угнетения активности глутатионредуктазы и в соответствии активности всех ферментов значениям контрольной группы на 3 сутки синдрома отмены этанола.
Таким образом, увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов при состоянии отмены этанола у экспериментальных животных в основном может быть обусловлено нарушением обмена глутатиона, которое выражается в уменьшении его внутриклеточной концентрации, а также в изменении активности ферментов глутатионовой системы. Положительные эффекты препарата «Мексидол» подтверждают наши предположения о важной роли нарушений обмена глутатиона при алкогольной абстиненции.