Scientific journal

International Journal of Experimental Education

ISSN 2618–7159

ИФ РИНЦ = 0,425

Плацента является важнейшим компонентом фето-плацентарной системы [1,2] и давно является объектом гистологического изучения. Многочисленные исследования указывают на нарушение в функционировании фето-плацентарного комплекса как на ключевую причину большинства осложнений беременности и родов у несовершеннолетних [3,4].

На протяжении всего периода гестации в плаценте с разной интенсивностью протекают два процесса: васкулогенез – образование сосудов из клеток-предшественников ангиобластов и ангиогенез – образование новых сосудов из уже существующих [5]. Васкулогенез включает в себя организацию кровеносных сосудов из прогениторных эндотелиальных клеток или ангиобластов и наблюдается исключительно во время эмбриогенеза [6]. Ангиогенез рассматривается, как пролиферация эндотелиальных клеток из уже существующих сосудов, данный процесс не ограничивается эмбриональным периодом и наблюдается при воспалении, иммунных реакциях, неоплазии [7]. Каждый из этих путей формирования кровеносных сосудов занимает особое место в течение беременности [8].

Важнейшей целью васкуло- и ангиогенеза является адекватная доставка кислорода к тканям развивающегося зародыша. Трофобласт обладает своей системой детекции кислорода, которая в настоящий момент не достаточно изучена [9]. Однако идентифицированы некоторые сигнальные пути, которые предполагают участие АФК и транскрипционных факторов, таких как HIF – гипоксия – индуцибельный фактор [10]. Активация HIF приводит к его связыванию с ДНК, привлечению тканеспецифических ко-факторов и трансактивации генов-мишеней, которые находятся под контролем уровня содержания кислорода: факторов роста (HIF-1 является ведущим активатором VEGF и PLGF), эритропоэтина и других сигнальных субстанций, вовлеченных в развитие гипоксического ответа [9,11].

Среди всех ангиогенных факторов семейство сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF) считается основным в новообразовании сосудов [12]. Белки, относящиеся к семейству VEGF, представляют собой гликопротеины, стимулирующие формирование новых кровеносных и лимфатических сосудов. Взаимодействие между VEGF и рецептором активирует остаток тирозина, находящегося в интрацитоплазматической части рецептора и запускает различные сигнальные каскады в эндотелиальных клетках, такие как пролиферация, миграция и увеличение сосудистой проницаемости [13]. Клетки трофобласта экспрессируют VEGF, обеспечивая дифференцировку, миграцию и пролиферацию клеток, формирование, рост и развитие сосудистой сети в период васкуло- и ангиогенеза.

Углубленное изучение состояния фето – плацентарного комплекса, особенностей его реакций в ответ на гипоксию на фоне незрелости организма несовершеннолетних может помочь выявить основные направления профилактики определенных осложнений беременности и родов у несовершеннолетних, в первую очередь – плацентарной недостаточности, гестоза, гипоксии плода. В общедоступной литературе нам не удалось обнаружить работ, посвященных иммуногистохимическим исследованиям экспрессии маркера гипоксии HIF-1α или VEGF-А в плацентах несовершеннолетних женщин.

Фрагментарные данные литературы послужили основанием для настоящего исследования.

Целью данной работы было изучить особенности гистологического строения плацент и экспрессии маркеров HIF-1α и VEGF-А в плацентах несовершеннолетних женщин.

Материалы и методы исследования. Гистологическим методом было исследовано 74 последа от несовершеннолетних пациенток. Группу сравнения составили 25 последов от здоровых женщин среднего репродуктивного возраста (20–30 лет).

Плаценты исследовались по стандартизованной схеме [2], включающей макроскопический анализ, вырезку материала и гистологическое исследование. Проводилось взвешивание и осмотр плацент. При этом определялась форма, количество долек, тип развития сосудов, место прикрепления пуповины. Производилась вырезка материала: 6 кусочков плацентарной ткани (2 – из краевой, 2 – из парацентальной и 2 – из центральной зон), также отбиралась средняя часть пуповины и спираль из плодных оболочек.

После взятия, материал фиксировался в 10 % растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 часов. В последующем образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (70–95 %), помещали в ксилол и заливали в парафин с помощью автоматической станции Leica TP1020. Для гистологического исследования готовили парафиновые срезы толщиной 3–7 мкм. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. При световой микроскопии с помощью микроскопа Olympus CX-31 (Япония) оценивалась плацента: строение виллезного дерева, компенсаторно-приспособительные реакции, состояние сосудистого русла и пластинок плаценты (базальная, хориальная), наличие или отсутствие воспалительных и дистрофических изменений в плаценте. Плодовые оболочки: соотношение анатомических составляющих (амниотический слой, трофобластический эпителий, децидуальная оболочка), наличие воспалительной реакции и дистрофических изменений. Пуповина: состояние Вартонона студня, количество и состояние сосудистого русла, наличие воспалительных изменений.

В иммуногистохимическое исследование были включены 35 плацент от несовершеннолетних пациенток, которые были разделены на три группы в зависимости от возраста: I группа (13–15 лет) – 8 плацент, II группа (16 лет) – 14 плацент, III группа (17 лет) – 16 плацент. В зависимости от наличия или отсутствия хронической плацентарной недостаточности несовершеннолетние пациентки также были разделены на две группы. Первую группу составили 11 плацент от несовершеннолетних пациенток с ХПН, вторую группу – 13 плацент от несовершеннолетних пациенток без ХПН по данным гистологического исследования.

Для изучения состояния сосудистого русла виллезного дерева плацент использовали моноклональные антитела эндотелиального сосудистого фактора роста VEGF-А (Clone UG1; 1:50, Dako), для оценки гипоксии в плаценте использовали антитела к маркеру гипоксия – индуцибельный фактор HIF -1α (H1 alpha 67; 1:100, GRTP (Abcam).

Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, помещенные на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). В качестве системы визуализации использовали набор Dako Cytomation LSAB2 System-HRP (Dako). Негативный контроль выполнен с применением блокирующей сыворотки (DAKO LSAB 2 kit). Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 7,6.

Методика для визуализации иммуногистохимической реакции выполнялась по стандартной схеме [14].

Для оценки результатов иммуногистохимического исследования проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus, цифровой камеры Olympus-BX46 и программного обеспечения «СellSens Entry». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 400 [15]. Из фотосъемки исключались поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания и артефакты. Дальнейшее количественное исследование проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений «Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия). При наличии положительной реакции на антитела было измерено два параметра: оптическая плотность и площадь экспрессии. Оптическая плотность выражалась в у.е.

Площадь экспрессии рассчитывалась как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах для маркеров с цитоплазматическим окрашиванием и как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными ядрами к общей площади ядер в поле зрения для маркеров с ядерной экспрессией.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы STATISTICA 6.1 (Statsoft Inc., Tulsa, США). Определение достоверности различий между сравниваемыми группами по частотам проводили с помощью критерия Фишера (F) или хи-квадрат (χ2) по стандартной формуле. Для оценки различий значений клинических параметров между различными группами применялся U-критерий Манна-Уитни или t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Регрессионный статистический анализ проводился с использованием коэффициента Пирсона для оценки линейной корреляции и коэффициентов Кендалла и Спирмена для учета возможной нелинейности взаимосвязи. Значение p<0.05 принималось как статистически значимое, значение p<0.1 расценивалось как тенденция.

Результаты исследования. Основные клинико-морфологические характеристики фето-плацентарной системы несовершеннолетних беременных женщин и женщин среднего репродуктивного возраста представлены в табл. 1.

Следует отметить, что масса плацент в группе несовершеннолетних составила 559,5±10,5 гр., что было достоверно больше, чем масса в группе женщин среднего репродуктивного возраста (478,7±12,9) (p<0.001). Плацентарно-плодовый коэффициент в группе несовершеннолетних составил 0,17±0,003, что было достоверно больше, чем плацентарно – плодовый коэффициент в группе женщин среднего репродуктивного возраста (0,14±0,003) (p<0.001).

В табл. 2 представлены основные гистологические характеристики последов несовершеннолетних беременных женщин и женщин среднего репродуктивного возраста.

Таблица 1

Основные клинико-морфологические характеристики фето-плацентарной системы несовершеннолетних беременных женщин и женщин среднего репродуктивного возраста

*p<0.001 при сопоставлении между группами.

Таблица 2

Основные гистологические характеристики последов несовершеннолетних беременных женщин и женщин среднего репродуктивного возраста

*p<0.05 при сопоставлении между группами.

В группе несовершеннолетних строение плаценты соответствовало сроку гестации в 49 (66,2 %) случаях, что было достоверно меньше, чем в группе женщин среднего репродуктивного возраста (23 (93,0 %)) (p<0.05). Следует отметить достоверную разницу (p<0.05) в частоте встречаемости выраженной степени циркуляторных нарушений между группами: 30 (40,5 %) случаев в группе несовершеннолетних и только 3 (12,0 %) случая в группе женщин среднего репродуктивного возраста (в этой группе все случаи выраженных циркуляторных нарушений в плаценте были обусловлены кесаревым сечением). Компенсаторно-приспособительные изменения в плацентах несовершеннолетних пациенток встречались достоверно реже в (64 случая, 86,5 %, p<0.05), чем в плацентах женщин среднего репродуктивного возраста (25 (100 %) случаев), и носили умеренный характер выраженности. Во всех плацентах изменения характеризовались небольшим количеством синцитиальных узелков, сохранением просвета интервиллезного пространства с умеренным кровенаполнением, отсутствием ишемических и геморрагических инфарктов.

Диссоциированная форма ХПН была диагностирована в 21 (28,4 %) случае и характеризовалась нарушением созревания виллезного дерева с персистенцией промежуточных зрелых ворсин хориона и уменьшением числа ворсин терминального типа. В 4 (5,4 %) случаях был выявлен гиперпластический тип хронической плацентарной недостаточности, характеризующийся обилием мелких терминальных ворсин в плаценте.

Воспалительные изменения в последах группы несовершеннолетних были выявлены в 26 (35,1 %) случаях и носили экссудативный 19 (25,7 %) случаев и продуктивный характер в 7 (9,5 %) случаев, при этом воспалительных изменений в последах женщин среднего репродуктивного возраста выявлено не было (p<0.05). Частота выявления экссудативного воспалительного процесса с вовлечением только плодных оболочек (бактериальное инфицирование 1 стадии, мембранозной) и всех составляющих последа (бактериальное инфицирование 3 стадии, пуповинной) составила 6 (8,1 %) случаев для мембранозной стадии и 7 (9,5 %) случаев для пуповинной. В структуре экссудативного воспалительного процесса преобладало поражение плодных оболочек (париетальный хориодецидуит и мембранит) и плаценты (субхориальный интервиллузит, плацентарный хориоамнионит) в 10 (13,5 %) случаях, в то время как воспалительные изменения в пуповине (флебофуникулит и сосудисто-стромальный фуникулит) присутствовали в 7 (9,5 %) случаях. Гематогенная инфекция в последах была диагностирована в 7 (9,5 %) случаях и проявлялась развитием диссеминированного продуктивного виллузита в 3 (11,5 %) случаях и продуктивного децидуита с париетальной и базальной локализацией в 4 (15,4 %) случаях от общего числа воспалительных изменений в последах несовершеннолетних.

Результаты иммуногистохимического исследования плацент от несовершеннолетних женщин в зависимости от возраста представлены в табл. 3.

Таблица 3

Экспрессия гипоксия-индуцибельного фактора – 1 (HIF-1α) в плацентах в зависимости от возраста женщин

Таблица 4

Экспрессия гипоксия-индуцибельного фактора -1 (HIF-1α) в плацентах в зависимости от наличия хронической плацентарной недостаточности

Как видно из табл. 3, межгрупповое сравнение площади экспрессии и оптической плотности экспрессии HIF-1α не выявило статистически значимых отличий. Для последующего анализа иммуногистохимического исследования экспрессии HIF-1α были выделы группы с гистологически установленной ХПН, данные представлены в табл. 4.

При сравнении внутри групп отмечалась тенденция к повышению площади экспрессии и оптической плотности HIF-1α в плацентах с ХПН.

В табл. 5 представлена экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-A) в плацентах в зависимости от возраста женщин.

Как видно из представленных данных, при межгрупповой оценке площади экспресии и оптической плотности маркера VEGF-A значимых отличий не отмечалось.

Сравнительная оценка экспрессии данного маркера в плацентах в зависимости от наличия или отсутствия хронической плацентарной недостаточности представлена в табл. 6.

При сравнении внутри групп отмечалась тенденция к повышению площади экспрессии и оптической плотности VEGF-A в плацентах с ХПН.

По результатам корреляционного анализа с использованием коэффициента линейной корреляции Пирсона не было выявлено значимой взаимосвязи между возрастом, площадью экспрессии и оптической плотностью маркеров HIF-1α и VEGF-A (p>0.05). Также не было выявлено значимой линейной взаимосвязи между площадью экспрессии одного и другого маркера, а также оптической плотностью обоих маркеров (p>0.05).

Таблица 5

Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-A) в плацентах в зависимости от возраста женщин

Таблица 6

Экспрессия сосудисто-эндотелиального фактора роста – A (VEGF-A) в плацентах зависимости от наличия хронической плацентарной недостаточности

Однако в соответствии с коэффициентами корреляции Кендалла и Спирмена наблюдается статистически значимая слабо отрицательная взаимосвязь между площадью экспрессии и оптической плотностью маркера HIF-1α (коэффициент Кендалла=-0,230, коэффициент Спирмена=-0,348, в обоих случаях p<0.05).

Заключение. Проведенное гистологическое исследование последов несовершеннолетних женщин и женщин среднего репродуктивного возраста не выявило достоверных различий между группами в массо-ростовых показателях детей и их оценке по шкале Апгар. Однако результаты проведенного исследования показали, что гистологическое строение плацент у несовершеннолетних беременных женщин, по сравнению с женщинами среднего репродуктивного возраста, характеризуется достоверной гипертрофией, и большей частотой хронической плацентарной недостаточности с выраженной степенью циркуляторных нарушений. В плаценте несовершеннолетних женщин степень компенсаторно-приспособительных реакций была ниже и достоверно чаще выявлялись воспалительные изменения.

Хроническая плацентарная недостаточность на момент рождения ребенка, выявляемая чаще у несовершеннолетних пациенток, может иметь значение в нарушении адаптационно-приспособительных механизмов и качестве жизни детей в постнатальном периоде. Следует также отметить, что масса плаценты и плацентарно-плодовый коэффициент в группе несовершеннолетних женщин по сравнению с женщинами среднего репродуктивного возраста были достоверно выше, что может указывать на неблагоприятные условия внутриутробного развития плода и плодово-плацентарных взаимоотношений у несовершеннолетних беременных женщин.

Проведенное иммуногистохимическое исследование выявило повышение экспрессии гипоксия – индуцибельного фактора (HIF-1α) и сосудисто-эндотелиального фактора роста – A (VEGF-A) в плацентах несовершеннолетних женщин с хронической плацентарной недостаточностью, по сравнению с плацентами несовершеннолетних женщин без таковой. Изучаемые факторы служат отражением активации ангиогенеза в ответ на внутриутробную гипоксию плода в условиях хронической плацентарной недостаточности.