Scientific journal

International Journal of Experimental Education

ISSN 2618–7159

ИФ РИНЦ = 0,425

Введение

Колоректальный рак (КРР) занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и смертности в развитых странах мира, выходя на третье место у мужчин и второе – у женщин [1, 6]. Рассматривая структуру заболеваемости раком среди мужского населения России, следует отметить, что злокачественные опухоли ободочной и прямой кишки занимают пятое и шестое место в общей статистике онкологических заболеваний. Суммарно, опухоли толстой и прямой кишки занимают второе место, уступая лишь раку легкого. Хирургия остается оптимальным методом лечения, поскольку диагностирование опухоли преимущественно на поздних стадиях заболевания требует оперативных и радикальных мер помощи пациенту в короткие сроки. Тем не менее, современные методы химиотерапии, направленные на уменьшение размеров опухоли, замедление опухолевого роста и предотвращение появления новых метастазов, не менее важны при лечении КРР.

Применение таргетных препаратов нового поколения, таких как моноклональные антитела к EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor - рецептор эпидермального фактора роста) позволило увеличить общую выживаемость пациентов с метастатическим КРР при наличии у них дикого типа гена KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue). Ген KRAS служит одним из звеньев сигнального пути EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK, регулирующего клеточную пролиферацию, ангиогенез, апоптоз и др. В случае КРР наиболее часто проявляются мутации гена KRAS в 12 и 13 кодонах, однако мутации в 61, 117 и 146 кодонах (менее 1%) также оказывают постоянный активирующий эффект на активность RAS белка. Результатом возникающей независимо от состояния EGFR постоянной активации сигнального пути EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK является нейтрализация эффекта блокирующих EGFR таргетных препаратов [2, 4, 10].

Изучению частоты мутаций гена KRAS и их связь с клининико-патологическими особенностями у пациентов с колоректальным раком были посвящены многочисленные исследования [1]. На Юге России подобные исследования ранее не проводились. Вместе с тем, население данной территории имеет свои популяционные особенности, что требует подробного изучения.

Цель исследования заключалась в изучении популяционного полиморфизма 7 SNP-мутаций соматического происхождения в гене KRAS опухолевых биоптатов пациентов с диагнозом КРР Юга России для адекватного назначения таргетных препаратов (цетуксимаб, панитумумаб). Определялась взаимосвязь обнаруженных мутаций с клинико-патологическими особенностями пациентов, получавших стационарное лечение в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Пациенты и методы

В настоящее исследование было включено 168 пациентов (73 мужчины, 95 женщин) в возрасте от 28 до 89 лет с морфологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы толстой или прямой кишки. Из фиксированных в 10%-м забуференном формалине и залитых в парафин образцов тканей опухолей получали срезы толщиной 8-10 мкм. Для молекулярно-генетического исследования использовали срезы, содержащие не менее 20% опухолевых клеток. Процедура экстракции ДНК включала в себя стандартную депарафинизацию срезов орто-ксилолом, отмывку 96-% этанолом, инкубирование при комнатной температуре в лизирующем буфере с протеиназой K в течение 12 часов и последующую инкубацию при температуре 900 в течение 1 часа. Затем образцы обрабатывали набором реагентов QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенной из образцов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Концентрация ДНК нормализовывалась до величины 1 нг/мкл. При помощи набора реагентов «Real-Time-PCR-KRAS-7M» («Биолинк», Россия) проводили определение 7 SNP-мутаций (Single Nucleotide Polymorphism) в 12 и 13 кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США).

Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2010 и STATISTICA 8.0. Определяли различия в группах, выделенных в соответствии с определенными признаками (пол, возраст, локализация первичной опухоли, степень дифференцировки опухолевых клеток, наличие метастазов в печень, регионарные и отдаленные лимфоузлы, стадия заболевания), у пациентов с мутантным и диким типом гена KRAS. Оценку различий проводили с использованием χ2-критерия, для уровня статистической значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Согласно данным клинических экспериментальных исследований, соматические мутации гена KRAS в опухолях толстого кишечника различных популяций очень вариабельны и встречаются от 30 до 60% случаев [1, 9]. Например, у афроамериканцев частота мутаций в гене KRAS составила 30,9% (n=222), у японцев – 37,6% (n=5790), у немцев – 49% (n=820), у итальянцев – 38,4% (n=107), у корейцев – 35,4% (n=82) соответственно. В исследованной нами группе пациентов c КРР I-IV стадии (n=168) мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS были обнаружены в 38,7% (n=65) случаев.

В ряде исследований, анализировавших связь между такими клинико-патологическими особенностями, как возраст, пол, локализация опухоли, глубина инвазии, наличие регионарных, или отдаленных метастазов, степень злокачественности, инвазия в сосудистое русло, размер опухоли статистически значимых отличий в проявлениях мутантного или дикого типов гена KRAS не было обнаружено [3]. Однако имеются данные о том, что мутантный ген KRAS чаще встречается в опухолях ректосигмоидного отдела и прямой кишки, чем в вышележащих отделах. [1]. Ассоциации между мутациями гена KRAS и различными клинико-патологическими особенностями пациентов представлены во многих исследованиях. Результаты проведенного нами исследования на Юге России свидетельствует о статистически значимой более высокой частоте проявления мутаций в гене KRAS при КРР у женщин по сравнению с мужчинами, а также более высокий уровень мутаций в гене KRAS при наличии метастазов в регионарные лимфоузлы (p<0,05). Кроме того, близки к статистически значимым различия в группах пациентов старшего возраста и с поздними стадиями заболевания (табл.1). Статистически значимых ассоциаций наличия мутантного типа гена KRAS в группах пациентов в зависимости от локализации первичной опухоли, степени дифференцировки опухолевых клеток, наличия метастазов печень и отдаленные лимфоузлы в данном исследовании не обнаружено. Тем не менее, в некоторых работах присутствуют данные о взаимосвязи между мутациями KRAS и клинико-морфологическими признаками.

Так, в популяциях пациентов с КРР раком в Швейцарии (n=404) и Турции (n=53) ассоциаций с возрастом, полом и дифференцировкой опухолевых клеток не выявлено, но показана связь между мутациями 13 кодона гена KRAS и стадиями развития заболевания по классификации Дьюка. Согласно другим данным, в том числе и нашего исследования, имеется связь мутаций гена KRAS с полом и наличием регионарных метастазов [7, 8, 9].

В проведенном исследовании в опухолях с мутантным типом гена KRAS (n=65) преобладающим типом мутаций оказались транзиции (69,2%), т.е. замены по типу «пуриновое основание на пуриновое» или «пиримидиновое основание на пиримидиновое», а на долю трансверсий пришлось соответственно 30,8%. (рис.1, табл. 2). Среди SNP-мутаций в 12 и 13 кодонах в обследованной группе наиболее часто встречались - G12D (32,7%) и G13D (24,7%).

Результатами многих исследований показано, что наиболее часто встречающимися SNP-мутациями при КРР являются транзиции (мутации G12D и G13D) с результирующей заменой глицина на аспарагиновую кислоту в белковой последовательности [3]. Среди пациентов с КРР на Юге России мутации G12D и G13D также встречаются чаще других мутаций (рис.1). Известно, что транзиции могут происходить спонтанно в результате ошибок репликации ДНК под действием пищевых генотоксических агентов и химических модификаций азотистых оснований . Также имеются сведения о влиянии профессиональных вредностей и курения на возникновение мутаций в 13-го кодоне гена KRAS [5].

Заключение

В проведенном исследовании впервые определена частота мутаций гена KRAS у пациентов с КРР на Юге России (38,7%), которая близка по своему значению к среднеевропейской (~40%). Больные с КРР нуждаются в определении статуса мутаций гена KRAS, играющего важную роль в плане дальнейшей стратегии химиотерапевтического лечения. Так, например, при наличии мутации в 13 кодоне возможно эффективное сочетанное применение традиционной химиотерапии с таргетными препаратами. В проведенном нами исследовании частота мутаций G13D составляет практически четвертую часть среди всех анализируемых изменений. Данная группа пациентов потенциально может получать таргетную терапию в сочетании с традиционной химиотерапией [9]. Выявленные ассоциации мутаций гена KRAS c клинико-патологическими особенностями позволяют с большей вероятностью ожидать мутации гена KRAS у женщин и при наличии регионарного метастазирования в лимфатические узлы. Также очень высока вероятность обнаружения мутаций в гене KRAS (12, 13 кодоны) у пациентов старше 55 лет (более чем на 50%) и на 3-4 стадиях развития онкологического процесса (более чем на 75%). Проведение молекулярно-генетического исследования среди пациентов с КРР позволило более полно охарактеризовать популяцию, проживающую на Юге России по частотам различных видов SNP-мутаций гена KRAS.