Введение
Исследования, направленные на изучение роли свободных аминокислот в онтогенезе животных, представляют особенный интерес, поскольку обеспечение физиологического транспорта аминокислот является важным условием при росте и развитии организма [3]. Аминокислоты – важнейшие биоэлементы, участвующие в синтезе биологически активных соединений (белки, ферменты, гормоны), осуществляют интеграцию основных метаболических потоков в организме. По количеству и разнообразию функций в энергетическом обмене и синтезе вторичных продуктов аминокислотный обмен занимает первое место в обмене веществ. Имеются данные об иммуностимулирующих и детоксицирующих свойствах аминокислот [1, 2, 6].
Данная работа посвящена изучению особенностей структуры аминокислотного пула в тканях молодых и взрослых особей хищной пиявки Haemopis sanguisuga L., 1758.
Большая ложноконская пиявка H.sangu-isuga – одна из самых крупных представителей пресноводных пиявок Палеарктики. Биология этой пиявки изучена довольно хорошо. Известно, что они размножаются летом, откладывают коконы во влажный грунт прибрежной полосы водоемов. Через месяц из коконов выходит молодь, которая растет и развивается довольно медленно – половая зрелость у H.sanguisuga наступает только в трехлетнем возрасте. Продолжительность жизни больших ложноконских пиявок – не менее 5-ти лет. H.sanguisuga принадлежит к числу весьма прожорливых хищников, заглатывающих свою добычу целиком или отрывая от нее куски значительных размеров. Сильная мускулатура, способность к плаванию, амфибиотический образ жизни обеспечивают эту хищницу разнообразной пищей, как в водоемах, так и в сырой прибрежной полосе. Взрослые особи пожирают самых разных животных, которых могут одолеть: червей (крупных олигохет, а также молодь пиявок), водных насекомых (большей частью их личинок), мягкотелых, небольших рыб, головастиков; H.sanguisuga не гнушается и падалью, выполняя функции «санитаров» в водных экосистемах [4, 7]. В рацион молоди этих хищниц входят только мелкие беспозвоночные, что, несомненно, должно отражаться на обменных процессах различных возрастных групп H.sanguisuga.
Материалы и методы
Пиявок отлавливали в прибрежной зоне Белоярского водохранилища (Свердловская область) в последнюю декаду августа. Масса тела молодых особей H.sanguisuga составила 0.13 ± 0.06 г, взрослых – 2.30 ± 0.41 г.
Состояние аминокислотного обмена оценивали методом ионообменной хроматографии с помощью автоматического анализатора аминокислот ААА-339М. Для анализа брали 1 грамм кожно-мышечной ткани пиявок и гомогенизировали с 3 мл калий фосфатного буфера (pH = 7.4). Гомогенат центрифугировали 15 мин в рефрижераторной центрифуге K-23D при 10 000 об./мин. Супернатант сливали в полиэтиленовую пробирку и добавляли 0.1 мл 30%-й сульфосалициловой кислоты для осаждения белков. Вторично центрифугировали содержимое пробирки 30 мин при 8 000 об/мин. Полученный супернатант наносили на колонку анализатора. Для исследуемого образца на хроматограмме прописывался весь спектр свободных аминокислот, и определялась концентрация каждой из них. Концентрацию свободных аминокислот в тканях выражали в мкмоль/100г. Рассчитывали содержание (% от суммарного фонда) незаменимых и заменимых аминокислот, их соотношение.
В эксперименте использовали 15 взрослых и 27 молодых особей H.sanguisuga. Проведено 440 элементоопределений.
Экспериментальный материал обработан стандартными методами математической статистики с использованием программ MS Excel 2003 и Statistica v.6.0. Значимость различий между группами оценивали с помощью критерия достоверности различий Стьюдента. Различия между сравниваемыми выборками считали статистически достоверными при p < 0.05.
Результаты и обсуждение
Показано, что в тканях обеих возрастных групп пиявок содержится 22 свободных аминокислоты и их производных (табл.). При этом у молодых особей отмечен повышенный уровень азотистого обмена – суммарные концентрации свободных аминокислот в их тканях в 2.2 раза выше, чем у взрослых особей (p < 0.05).
Таблица
Содержание свободных аминокислот (АК, мкмоль/100г влажной ткани) в тканях молодых и взрослых особей H. sanguisuga
|
АК Мкмоль/100г |
H.sangusuga молодь |
H.sangusuga взрослые |
|
Cysteic Acid Taurine Aspartic Acid Treonine Serine Glutamic Acid +Glu Proline Glycine Alanine Valine Cystine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Tryptophan Ornithine Lysine Histidine Arginine |
8.48 ± 1.10* 19.5 ± 2.67 204.7 ± 8.11 52.6 ± 5.52 72.6 ± 5.64 645.2 ± 14.2 164.7 ± 5.76 181.7 ± 6.26 228.6 ± 7.99 133.6 ± 6.16 3.77 ± 0.27 30.7 ± 4.53 19.5 ± 2.82 75.3 ± 4.85 25.4 ± 4.35 35.6 ± 2.81 4.64 ± 0.34 26.3 ± 2.98* 75.4 ± 4.34 22.1 ± 2.69 30.5 ± 3.53 |
9.41 ± 0.58 следы 88.4 ± 2.05 29.4 ± 2.15 46.3 ± 1.71 218.8 ± 5.03 44.6 ± 2.51 80.3 ± 2.09 169.2 ± 3.64 6.74 ± 0.31 2.28 ± 0.10 16.5 ± 0.96 13.2 ± 0.40 60.5 ± 2.24 15.3 ± 0.43 20.4 ± 0.88 следы 25.6 ± 1.05 59.3 ± 1.98 12.4 ± 0.55 8.95 ± 0.05 |
|
Суммарный фонд АК НАК % ЗАК % НАК/ЗАК |
2060.9 ± 87.5 23.3 74.1 0.31 |
927.6 ± 73.4 24.4 71.8 0.34 |
*- p > 0.05
Аминокислотный фонд молодых пиявок повышен за счет 20 аминокислот. Только концентрации цистеиновой кислоты и орнитина в тканях пиявок обеих групп не показали достоверных различий (p > 0.05). У молоди особенно высоко тканевое содержание аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глутамина, пролина, глицина, и аргинина, концентрации которых превышают содержание их у взрослых особей в 2.3, 2.9, 3.7, 2.3, и 3.4 раза соответственно (p < 0.05). А содержание незаменимой аминокислоты валина, используемого мышечной тканью в качестве источника энергии и обладающего иммуностимулирующими и детоксицирующими свойствами, у молоди в 20 раз больше, чем у взрослых (p < 0.05). Отмечено, что в тканях растущих пиявок содержится значительное содержание таурина и незаменимой аминокислоты триптофана, которые у взрослых особей присутствуют только в следовых количествах.
Процентное содержание пула заменимых аминокислот в тканях молодых пиявок составляет 74.1% от суммарного фонда, при этом более 31% приходится на долю глутаминовой кислоты и глутамина (рис.1).
Глутаминовая кислота занимает центральное место в процессах переаминирования в организме, участвует в углеводном обмене и является одним из источников гликогена. Важна роль глутаминовой кислоты и глутамина в обезвреживании аммиака, образующегося в процессе жизнедеятельности животных [1].
У взрослых особей процентное содержание (от общего фонда) заменимых аминокислот несколько ниже, чем у молоди – 71.8%. Однако уровень серина, аланина и тирозина превышает процентное содержание этих аминокислот в тканях растущих пиявок (рис.1).
Рис. 1. Содержание (% от суммарных концентраций АК) заменимых аминокислот в тканях молодых и взрослых особей хищной пиявки H.sanguisuga
Содержание незаменимых аминокислот в тканях молодых пиявок составляет 23.3% от суммарного фонда, при этом более 6% приходится на долю валина (рис.2). Валин вместе с лейцином и изолейцином служит источником энергии в мышечных клетках и участвует в поддержании нормального обмена азота в организме [3]. Следует отметить достаточно высокий уровень содержание аргинина, который участвует в синтезе гормона роста (рис.2).
Рис. 2. Содержание (% от суммарных концентраций АК) незаменимых аминокислот в тканях молодых и взрослых особей хищной пиявки H.sanguisuga
У взрослых особей содержание незаменимых аминокислот несколько выше, чем у молоди – 24.4%. При этом более 12% приходится на долю лейцина и лизина (рис.2). Лейцин, вероятно, компенсирует пониженный уровень валина в тканях взрослых пиявок. Лизин участвует в синтезе антител, гормонов и ферментов.
При всех обнаруженных существенных различиях в содержании свободных аминокислот соотношение незаменимых аминокислот к заменимым (НАК/ЗАК) у обеих групп пиявок сопоставимо – 0.31 у молоди и 0.34 у взрослых особей. Стабильный уровень незаменимых аминокислот в тканях пиявок является важным условием для нормальной жизнедеятельности. Авторами было показано, что процентное содержание незаменимых аминокислот в тканях хищной пиявки H.sanguisuga (23-24%) значительно выше, чем у кровососущих медицинских пиявок Hirudo verbana (12-16%) [5].
Проведенные исследования выявили существенные возрастные различия состояния аминокислотного пула у пиявки H.sanguisuga. Рост и развитие пиявок сопровождается высоким уровнем азотистого метаболизма, обусловленный повышенными тканевыми концентрациями свободных аминокислот: валина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глутамина, пролина, таурина, триптофана, глицина и аргинина.