Введение
Среди различных классов химических соединений, применяемых в современном сельском хозяйстве и лесоводстве, наиболее отрицательным сопутствующим действием обладают, пестициды [2].
К настоящему времени накоплен значительный фактический материал, показывающий, что многие пестициды действуют непосредственно на наследственные структуры, вызывая их стойкие изменения, мутации [3].
Триазиновые гербициды используются в сельскохозяйственной практике для защиты зерновых, овощных культур и виноградников от сорных растений. Они весьма разнообразны как по химической природе, так и по генотоксичности. Изучение мутагенной активности на про- и эукариотных организмах показало, что среди триазиновых гербицидов обнаруживаются прямые мутагены и промутагены, генотоксичность которых регистрируется только с помощью растительных и животных клеток.
Для определения мутагенного действия пестицидов применяют различные тест-объекты: микроорганизмы, растения, насекомые, млекопитающие. 71% изученных пестицидов проявили мутагенную активность в бактериальных тестах с метаболической активацией и без нее.
Растения непосредственно контактируют с мутагенами среды, адсорбируя их на поверхности и подземных органах или поглощая через корни. Дальнейшая судьба ксенобиотиков зависит от направленности ферментативных превращений в клетках и тканях растений. Известно, что некоторые мутагены подвергаются активации или дезактивации.
К настоящему времени известно, что биотрансформация пестицидов в растениях может осуществляться при помощи двух разных ферментных систем – микросомальными монооксигеназами, преимущественно ферментами цитохрома Р-450 и пероксидазами, осуществляющими 1-электронное окисление.
Цель исследования: изучение механизмов метаболической трансформации триазиновых гербицидов под влиянием ферментных систем растений в мутагены.
Материал и методы исследования
В работе были использованы индикаторные системы: индикаторные штаммы: Salmonella typhimurium: ТА-98 his D3052, rfa, uvr B, pKM 101; TA 100- his G46, rfa uvr B pKM 101; семена ячменя Hordeum vulgare L. сорта Черниговский-5.
При выполнении работ использовались следующие методы:
1. полуколичественный метод учета генных мутации у индикаторных бактерий S. typhimurium. Использовали чашечный тест Эймса. Мутагенный эффект учитывался по кратности превышения числа ревертантов, индуцированных препаратами, над спонтанным фоном [4];
2. приготовление растительной активирующей смеси. Проростки ячменя выращивали в течение 5 суток в лабораторных условиях с естественной фотопериодичностью, затем растения собирали, измельчали и замораживали. Растительный материал гомогенизировали в ступке, добавляя двойной объем фосфатного буфера (рН 7,4), и центрифугировали 15 минут при режиме 9000g и температуре 2-4оС. Супернатантную жидкость отбирали и сразу использовали в опыте. В экспериментах использовали полную активирующую смесь (ПАС) и неполную активирующую смесь (НАС). В состав ПАС входили: исследуемый препарат, суспензия бактерий, растительный гомогенат и кофакторы, необходимые для работы окислительно-восстановительных ферментов. В вариантах с НАС вместо кофакторов вносили соответствующий объем растворителя – воды;
3. полуколичественный учет генных мутации с активацией препаратов ферментными системами растений в условиях in vivo. Проростки растений в течение двух недель обрабатывали различными концентрациями триазиновых гербицидов, затем из этих растений готовили гомогенат и на индикаторных бактериях определяли их мутагенную активность.
Результаты исследования и их обсуждение
Об участии тех или иных ферментов, осуществляющих мутагенную активацию пестицидов, можно судить по результатам экспериментов, в которых используются ингибиторы, или наоборот, индукторы энзимов. Этот подход мы использовали для выяснения возможных биохимических особенностей активации промутагенных триазиновых гербицидов атразина, пропазина и симазина.
В качестве ингибитора пероксидаз использовали диэтилдитиокарбамат (ДЭДК), а ингибитора цитохромного комплекса – метирапон. Микросомными индукторами служили – совол, фенобарбитал и 2,4-дихлоруксусная кислота (2,4-Д).
Растворами ДЭДК в концентрации 100, 250 и 500 мМ обрабатывали растения ячменя в течение всего времени их роста. Из обработанных проростков готовили микросомальные супернатанты, в которых определяли активность пероксидазы. ДЭДК в дозе 500 мМ почти полностью подавлял пероксидазную активность, поэтому в экспериментах по определению роли пероксидазы в мутагенной активации триазинов использовали гомогенаты растений, обработанные ДЭДК в концентрации 250мМ, в которых активность пероксидазы снижалась на 50-70%.
Активирующую способность гомогенатов оценивали по уровню мутагенного эффекта, индуцированного пропазином, симазином и атразином у индикаторного штамма S.typhimurium TA98. В экспериментах использованием ДЭДК не наблюдалось статистически значимого снижения регистрируемого эффекта, что свидетельствует о несущественной роли пероксидазы в мутагенной активации триазиновых гербицидов.
Другим ферментом, принимающим участие в метаболизме ксенобиотиков в растениях, является цитохром Р-450. Для выявления роли микросомальных монооксигеназ в мутагенной активации триазинов приведены три варианта экспериментов. Во-первых, определяли участие кофакторов в метаболической активации триазинов, что служит косвенным указанием на участие этой системы микросомального окисления трансформации триазинов. Во-вторых, изучали влияние ингибиторов и индукторов монооксигеназ на активность цитохромов Р-450 в гомогенатах ячменя в условиях in vivo и in vitro. В третьих, исследовали влияние индукторов и ингибиторов микросом на трансформацию промутагенов в мутагены.
Для активации триазинов наличие кофакторов в активирующей смеси является существенным – в этом случае число ревертантов, индуцированных пропазином в 2,1-2,5, симазином в 1,9-2,5, атразином в 1,7-2,1 раза выше, чем в вариантах с неполной активирующей смесью. Влияние кофакторов, обеспечивающих более эффективное функционирование системы микросомального окисления на мутагенную активацию триазинов, косвенно указывает на участие этой системы в их трансформации в мутагены.
Для подтверждения этого предположения провели эксперименты с индукторами и ингибиторами микросомальных монооксигеназ. В качестве маркерной реакции на активность цитохрома Р-450 у растений использовали реакцию гидроксилирования коричной кислоты, которую измеряли по изменению интенсивности окраски.
Метирапон, являясь эффективным ингибитором растительных цитохромов Р-450, в дозе 25мМ на 40% и дозе 50мМ, на 70% снижал уровень активности цитохромов в гомогенатах растений. Из индукторов цитохрома Р-450 наиболее эффективное действие оказывал 2,4 Д, коэффициент индукции в дозе 200мМ составлял 3,2.
Из обработанных индукторами и ингибиторами (метирапон – 50мМ, совол – 100мМ, фенобарбитал, 2,4Д – 200мМ) гомогенатов растений готовили микросомальные супернатанты с целью выявления их роли в активации триазинов (таблица).
Таблица
Влияние индукторов и ингибиторов на растительную активацию пропазина, атразина и симазина
|
Препарат |
Концен- трация мг/мл |
Количество ревертантов на чашку |
|||||
|
-S9 |
+S9 |
S9 |
|||||
|
совол |
Фенобар битал |
2,4Д |
Метирапон |
||||
|
Пропазин |
10 |
32±1,6 |
390±21,0 |
452±26,0 |
610±35,0 |
1716±100,0 |
70±3,9 |
|
1 |
23±1,2 |
312±18,0 |
390±22,0 |
446±27,0 |
23±1,2 |
58±3,5 |
|
|
0,1 |
17±0,9 |
170±10,0 |
231±14,0 |
351±21,0 |
17±0,9 |
34±1,8 |
|
|
контроль |
21±1,0 |
26±1,3 |
32±1,8 |
36±1,9 |
21±1,0 |
30±1,6 |
|
|
Атразин |
10 |
24±1,3 |
172±11,0 |
361±20,0 |
550±33,0 |
600±40,0 |
43±2,2 |
|
1 |
18±0,9 |
146±8,3 |
310±18,0 |
503±27,0 |
510±31,0 |
30±1,6 |
|
|
0,1 |
17±1,0 |
131±7,7 |
225±13,0 |
390±23,0 |
415±24,0 |
22±1,1 |
|
|
контроль |
17±0,9 |
22±1,2 |
21±1,0 |
36±1,9 |
30±1,6 |
20±1,0 |
|
|
Симазин |
10 |
26±1,5 |
212±11,0 |
394±23,0 |
482±29,0 |
623±38,0 |
30±1,6 |
|
1 |
21±1,1 |
165±8,7 |
341±19,0 |
395±23,0 |
609±35,0 |
27±1,5 |
|
|
0,1 |
19±1,1 |
145±8,8 |
236±13,0 |
260±15,0 |
500±31,0 |
24±1,4 |
|
|
контроль |
17±1,0 |
22±1,2 |
30±1,6 |
32±1,7 |
32±1,6 |
20±1,0 |
|
Метирапон почти полностью подавлял активацию атразина, симазина и пропазина. Наблюдалось снижение мутагенной активности пропазина в 5-5,6, симазина в 6-7, атразина в 4-6 раза по сравнению с контролем. Увеличение микросомальной активности растительных гомогенатов приводило соответственно к возрастанию мутагенного эффекта всех трех препаратов. Наиболее эффективным микросомальным индуктором оказался 2,4Д, мутагенная активность пропазина – активированного гомогенатом, индуцированным 2,4Д в 4,4, атразина в 4, симазина в 4,1 раза превосходила таковую без индукции.
Известно, что трансформация пестицидов в растениях осуществляется как микросомальными монооксигеназами, преимущественно ферментами цитохрома Р-450, вызывающими гидроксилирование, эпоксидирование и дезалкилирование, так и 1-электронным окислением, индуцируемым пероксидазой.
Нами впервые изучен возможный биохимический механизм растительной биотрансформации триазинов в мутагены. Используя ингибиторы и индукторы растительной пероксидазы и цитохромов, нам удалось показать, что мутагенная активация исследованных триазинов не протекает по пероксидазному механизму, а осушествляется в ходе микросомального окисения. Это особенно наглядно продемонстрировано в экспериментах с использованием гомогенатов из обработанных индукторами растений [1].
Для индуцирования растительных микросом используются различные агенты Fe 3+ , Mn 2+ ионы, свет, гербициды, этанол, инкубирование в воде. Нами впервые была предпринята попытка индуцировать микросомы с помощью фенобарбитала, совола и 2,4Д, обычно применяемые для индукции микросом печени. Наибольшее усиление мутагенного эффекта триазинов отмечено в присутствии фракции S9 ячменя, предварительно обработанного 2,4 Д, что коррелирует с увеличением активности цитохрома Р-450 в растениях, обработанных индукторами. Это позволяет рекомендовать 2,4 Д в качестве наиболее эффективного индуктора растительных микросомальных монооксигеназ.
Выводы
По результатам проведенных исследовании были сделаны следующие выводы:
1. Ингибитор пероксидазы ДЭДК не влияет или слабо влияет на мутагенную активность триазинов, т.е. пероксидазы не играют существенный роли в биотрансформации промутагенных триазинов;
2. В биотрансформации промутагенов в мутагены участвуют микросомальные монооксигеназы.