В селекции многих сельскохозяйственных культур все шире применяются биотехнологические приемы, в том числе методы клеточной селекции, андроклинии и генетической трансформации клеток. Однако до сих пор не создано надежной технологии массового производства линий-регенерантов любых генотипов на основе клеточных и тканевых культур in vitro. Основной проблемой остается высокая степень зависимости результативности тех или иных методик от генотипа донорных растений. До сих пор не удалось установить генетическую детерминацию морфогенетических процессов in vitro и разработать на этой основе универсальные приемы оптимизации метода культивирования соматических тканей.
В течение полутора десятков лет в Саратовском госагроуниверситете им. Н.И. Вавилова ведутся исследования по поиску эффективных методов культивирования клеток и тканей растений in vitro, в том числе мягкой и твердой пшеницы.
Основной задачей изучения является поиск эффективных генов, способных повышать морфогенетическую активность и регенерационную способность клеток и тканей in vitro. Для этого исследуются эффекты генов короткостебельности на процессы, протекающие в культуре соматических тканей и пыльников мягкой и твердой пшеницы. Проводили скрининг набора почти изогенных сестринских линий, альтернативных по генам Rht-В1b, Rht-В1с, Rht-14, s1, Q.
В результате проведенных исследований установлено, что в культуре пыльников in vitro гены системы Rht, а также s1 и Q в генофоне сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 могут оказывать существенное влияние на формирование морфогенных пыльников, гаплоидных новообразований и растений-регенерантов (Tkachenko O.V., Djatchouk T.I., LobachevYu.V., 2000). Среди взятых в изучение линий во все годы изучения достоверное превышение изучаемых показателей отмечалось у линий с генами Rht-B1c и Q. Линии с этими генами достоверно превышали соответствующие высокорослые сибы по следующим показателям: выход морфогенных пыльников, выход гаплоидных новообразований, выход растений-регенерантов, в % от общего количества инокулированных пыльников. Положительное влияние на все этапы гаплопродукции также отмечалось у линии с геном Rht 14, но статистически достоверные отличия обнаружены не во всех экспериментах.
У линии с геном s1 отмечалось снижение выхода морфогенных пыльников и новообразований. На регенерацию растений данный ген существенного влияния не оказывал. Линия с геном Rht-B1b ни в одном эксперименте существенно не отличалась от своего высокорослого сиба ни по одному показателю.
В то же время, сравнительное изучение влияния гена Rht-B1b на этапы культивирования пыльников трех сортов твердой пшеницы показало достоверное снижение эффективности культивирования гаплоидных структур в генофоне двух из них.
Анализ соматических каллусных культур, полученных из незрелых зародышей, показал, что при внесении в генофон сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 гены короткостебельности могут оказывать существенное влияние на формирование меристематических очагов в тканях и способность к сохранению регенерационной активности в процессе длительного культивирования каллусов (Tkachenko O.V. and Lobachev Yu.V., 2008). Выявлены гены Rht-B1c и Rht14, обладающие сильным положительным эффектом на формирование морфогенных каллусов и сохранение регенерационной способности в процессе пассирования. При этом гены s1 и Q достоверно тормозили морфогенетические процессы в каллусах. Ген Rht-B1b в двух генотипах из трех также снижал эффективность закладки меристематических очагов и регенерации растений.
В результате проведенных исследований установлено, что гены, основным эффектом которых in vivo является снижение высоты растений, в культуре клеток и тканей in vitro оказывают различное качественное и количественное влияние на отдельные морфогенетические процессы. Выявлены гены, обладающие достоверным положительным эффектом на формирование каллусов с зонами меристематической активности и растений регенерантов.
Другим направлением исследований являлось изучение влияния различных химических веществ на эффективность этапов культивирования клеток и тканей пшеницы in vitro и регенерацию целых растений. В процессе совместных исследований с сотрудниками кафедры химии Саратовского госагроуниверситета было изучено несколько новых веществ и у одного из них обнаружена росторегулирующая и морфогенетическая активностью при введении в культуру in vitro. Данная разработка защищена в 2002 г. патентом РФ № 2186768.
Следующим направлением исследований, проводимых в настоящее время, является изучение влияния живых ассоциативных организмов, а именно бактерий рода Azospirillum на каллусные ткани и растения-регенеранты в культуре in vitro. Обнаружено, что не только сами бактерии, но и отдельные компоненты их клеточных стенок – липополисахариды способны стимулировать морфогенетические процессы в каллусах пшеницы (Tkachenko O.V. at all., 2012).
Еще одним направлением исследований стала разработка методов контроля процессов, протекающих в культуре клеток и тканей in vitro. Совместно с учеными Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН методом иммуноферментного анализа была установлена связь между морфогенетическими процессами в каллусе и накоплением особого белкового компонента – пролиферативного антигена инициальных клеток меристем (ПАИ) (Евсеева Н.В. и др., 2007). Установлено, что клеточные культуры, несущие ген Rht-B1c накапливают ПАИ интенсивнее, что отражает повышенную морфогенетическую активность этих линий. Кроме того, была установлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы, заключающаяся в снижении уровня его содержания в процессе каллусогенеза и повышении уровня его содержания при вторичной дифференциации клеток до определенного максимального уровня в процессе регенерации растений. Было определено уравнение для кривой линии, описывающей этот процесс. В результате был предложен новый молекулярный маркер, отражающий интенсивность процессов дифференциации клеток и формирования очагов меристематической активности, приводящей к регенерации растений in vitro.
Таким образом, проведенные исследования открыли новые пути оптимизации существующих на сегодняшний день методов культивирования клеток и тканей растений in vitro, в том числе мягкой и твердой пшеницы, что позволит более эффективно применять биотехнологии в селекции сельскохозяйственных культур, в том числе пшеницы.