Одним из приоритетных направлений развития технологий в разделе «науки о жизни» является совершенствование сорбентов для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этот современный и достоверный метод широко используется для определения содержания лекарственных препаратов в биологических жидкостях человека, в том числе для терапевтического мониторинга транквилизаторов, нейролептиков и антидепрессантов. Использование для этих целей слюны, в отличие от забора крови, не нарушает кожный покров и снижает риск передачи СПИДа, гепатита и т.д. Забор слюны, в отличие от мочи, не требует специальных условий. Слюна является практически безбелковым ультрафильтратом крови и концентрация лекарственного препарата в ней пропорциональна его плазматической концентрации для препаратов, не связанных с белками плазмы [1].
При использовании для ВЭЖХ-анализа обычных обращенно-фазовых сорбентов (ОФС), чьи гидрофобные поверхности необратимо сорбируют белковые компоненты слюны, требуется изолирование нейролептиков или иных лекарственных препаратов с помощью довольно длительной и трудоёмкой пробоподготовки, которая повышает стоимость анализа и увеличивает его продолжительность в два-пять раз. При этом требуемый объём слюны составляет около 5 мл и на его получение требуется 3 мин при стимуляции слюноотделения жеванием [1]. Помимо того, что это не слишком удобно, такой отбор возможен лишь при нахождении пациента в сознании.
Преодоление указанных трудностей возможно при использовании гетероповерхностных сорбентов (ГС) вместо традиционных обращенно-фазовых. «Умные поверхности» ГС обеспечивают эксклюзию макромолекул пробы без разделения и со скоростью, близкой к скорости движения подвижной фазы, а для остальных компонентов пробы реализуют разделение по одному или нескольким механизмам. Это позволяет ограничиться фильтрацией пробы перед ее вводом в хроматографическую колонку, и не выполнять все остальные стадии обычной пробоподготовки. Помимо сокращения времени анализа существенно уменьшается требуемый объём слюны, что позволяет осуществить её отбор одномоментно.
Материалы и методы исследования. Для синтеза ГС можно использовать готовые обращенно-фазовые сорбенты (ОФС) или модифицировать поверхность кремнезёма алкилсиланами самостоятельно. Необходимо, чтобы используемый для синтеза гетероповерхностного сорбента ОФС имел узкое распределение пор по размерам с максимумом около 5 нм. При невозможности проведения порометрических испытаний ОФС, рекомендуется синтезировать небольшие количества ГС на основе условно годных ОФС и сравнить данные элементного анализа на содержание в них углерода. Чем ближе полученные данные, тем больше подходит ОФС для синтеза ГС.
После синтеза алкилмодифицированного кремнезема с привитыми гексадецильными группами, производили экранирование внешней поверхности человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) с его последующей сшивкой в соответствии с методикой, изложенной в [2]. В процессе сорбции альбумина на поверхности алкилкремнезема осуществляли периодическую ультразвуковую обработку с помощью прибора УЗДН-1 на частоте 22 кГц суммарной продолжительностью 7 мин. Раствор ЧСА предварительно дегазировали, чтобы уменьшить деструкцию альбумина из-за кавитации. После промывки на фильтре, сорбированные глобулы альбумина сшивали глутаровым альдегидом и восстанавливали азометиновые связи раствором боргидрида натрия. Структурно-геометрические характеристики кремнезёма, ОФС и ГС контролировали с помощью порометрической лаборатории «Carlo Erba Strumentazione». Полученный ГС и исходный ОФС сорбент упаковывали суспензионным способом в колонки из коррозионно-стойкой стали длиной 12 см и внутренним диаметром 4 мм и изучали на жидкостном хроматографе. Использовался градиентный насос высокого давления Spectra SYSTEM P4000, двухволновой сканирующий УФ-детектор UV2000 фирмы Thermo Electron Corp. и петлевой кран-дозатор «Rheodine-7125» с объемом петли 25 мкл. В качестве подвижной фазы применяли смесь фосфатного буферного раствора с ацетонитрилом различной концентрации. Элюирование производили в изократическом режиме со скоростью подачи 1 мл/мин, детектирование осуществляли на длине волны 254 нм.
Для сопоставления свойств ГС и традиционных ОФС были проведены их хроматографические испытания на модельной смеси лекарственных препаратов. Время удерживания является функцией по крайней мере трёх основных параметров подвижной фазы: pH, ионной силы и концентрации органического растворителя в элюенте. Варьирование первых двух изменяет ионообменные свойства экранирующих молекул ЧСА на поверхности ГС (так как белок – полиэлектролитная молекула), что может влиять на время удерживания лекарственных препаратов. Поэтому в качестве тестовых веществ были выбраны как кислые, так и основные сорбаты: аспирин и бензойная кислота содержат карбоксильные группы, а функциональные группы теофиллина, кофеина и сульпирида имеют основную природу.
Результаты исследования и их обсуждение. При изменении pH элюента 0,02 М натрийфосфатный буферный раствор – ацетонитрил (95:5) в диапазоне от 3 до 7,5 кривые зависимости времени удерживания от pH практически подобны. В случае аспирина и бензойной кислоты при pH ˂ 5 удерживание на обоих сорбентах резко увеличивается. На колонке с ГС при pH ˂ 4 аспирин (ацетилсалициловая кислота) полностью поглощается сорбентом из-за взаимодействия с протонированными аминогруппами ЧСА.
Для элюента натрийфосфатный буферный раствор (pH = 6,5) – ацетонитрил (95:5) варьирование концентрации NaH2PO4 в буферном растворе от 0,02 до 0,2 М не влияет на удерживание теофиллина, кофеина и сульпирида, что свидетельствует о незначительности ионообменных взаимодействий молекул сорбатов с ЧСА на поверхности ГС.
При уменьшении содержания ацетонитрила в элюенте 0,02 М натрийфосфатный буферный раствор – ацетонитрил (pH = 6,5) от 20 до 15 % время удерживания на обеих колонках практически не изменяется. При дальнейшем снижении концентрации ацетонитрила до 5 % наблюдается значительное увеличение времени удерживания теофиллина, кофеина и сульпирида вследствие усиливающегося неспецифического взаимодействия этих молекул с привитыми гексадецильными группами обоих сорбентов.
Во всех рассмотренных случаях время удерживания на ГС несколько меньше, чем на ОФС. Процент обнаружения белковой фракции пробы на выходе из хроматографической колонки достигает 98 %.
Выводы. Судя по полученным результатам, применение ГС позволяет вводить в хроматографическую колонку образцы слюны после фильтрации, исключив нежелательные стадии предварительной подготовки пробы. Сходство характеристик удерживания на гетероповерхностном сорбенте и на широко используемых гидрофобных сорбентах позволяет использовать отработанные методики определения лекарственных препаратов.