Scientific journal

International Journal of Experimental Education

ISSN 2618–7159

ИФ РИНЦ = 0,425

Механизмы естественной устойчивости к туберкулезу остаются во многом не понятны, что не позволяет разработать эффективные средства патогенетической терапии. Особенно это актуально для туберкулеза с лекарственной устойчивостью, при сочетании туберкулеза и ВИЧ инфекции, других тяжелых сопутствующих заболеваниях. Тяжелая туберкулезная инфекция сопряжена с прогрессирующим нарастанием свободнорадикальных процессов в пораженных специфическим процессом тканях, чему способствуют нарушения обмена железа и серы, что отмечалось еще в 50–60-х годах прошлого века [3,4]. Но как воздействовать на эти нарушения и в настоящее время во многом не понятно.

Целью наших исследований было сопоставить защитные механизмы с участием железа и серы в тканях устойчивых и чувствительных к туберкулезу животных.

Материалы и методы исследования

Опыты проводились на устойчивых к микобактериям туберкулёза (МБТ) крысах, и высокочувствительных к МБТ морских свинках. Животные были взяты из питомника Уральского НИИ фтизиопульмонологии, которые содержались в стандартных условиях вивария согласно принятым требованиям. План эксперимента был рассмотрен и утверждён биоэтической комиссией УНИИФ. Всего в исследованиях было 20 морских свинок (10 опытных и 10 контрольных) и 20 крыс (10 опытных и 10 контрольных) массой 200 – 250 гр. В возрасте 2 – 3 месяца. План эксперимента был рассмотрен и утвержден биоэтической комиссией УНИИФ. Для воспроизведения экспериментального туберкулеза использовали музейный штамм микобактерий Центрального НИИ туберкулеза Н37Rv (1993 г.). Морские свинки заражались в паховую складку в дозе 0,001 мг, крысы дозой 0,1 мг 2-недельной живой культурой. Выведение из эксперимента производилось через 6 недель после заражения при развитии у морских свинок генерализованного туберкулеза.

Для определения исследуемых показателей у животных под наркозом забирали кровь из сердца. В крови исследовали содержание гемоглобина общепринятым методом.

Костный мозг получали из бедренных костей. Готовили мазки, которые окрашивали по Поппенгейму. Клеточность костного мозга определяли на гемоцитометре.

Общее количество железа в исследуемой ткани определяли при помощи атомно-абсорбционного спектрофотометра «Спираль-14» после минерализации ткани при 450 градусах С.

Сульфатную серу в биологическом материале определяли спектрофотометрически с использованием барий- желатинового реактива.

Для биохимических исследований были заморожены образцы сыворотки крови и лейкоцитарной взвеси.

При помощи иммуноферментного анализатора в плазме крови и лейкоцитах исследовали уровень суммарных перекисей липидов (по показателям OXYSTATA производства BiomedicaGRUPPE) и стабильных производных (нитрата) оксида азота (RandDSystems). При помощи газожидкостной хроматографии на анализаторе ААА 339М «Микротехника» после замораживания тканей в жидком азоте определяли количество свободных аминокислот и глутатиона восстановленного и окисленного, полиаминов.

Для статистической обработки данных использовали непараметрические методы с обработкой полученных данных в программе Excel. Оценка степени достоверности различий между группами оценивалась по критерию «U» Манна–Уитни.

Работа выполнена согласно темам НИОКР УНИИФ Минздрава РФ № 114032140001 и 01201352042 ИИФ УО РАН.

Результаты исследования и их обсуждение

На момент выведения из эксперимента у всех зараженных морских свинок развивался генерализованный туберкулез с преимущественным поражением селезенки, печени, лимфоузлов, легких. У крыс, не смотря на то, что доза заражения была в 100 раз большей, туберкулезный процесс не развивался.

Исследование крови подопытных животных показало, что у морских свинок генерализация туберкулезного процесса сопряжена с развитием железодефицитной анемии. Так, если в норме гемоглобин в крови морских свинок составлял 149г/л, то через 6 недель после заражения он был равен 78г/л (2-кратное снижение (р <0,01). У крыс уровень гемоглобина был 164 г/л и существенно не менялся после введения им МБТ. На этом фоне в органах менялось содержание железа в тканях. В легком, печени, селезенке, костном мозге морских свинок его количество уменьшалось в 2-3 раза (р< 0,01 во всех случаях). У крыс существенное уменьшение количества железа было только в селезенке- почти в 2 раза (р< 0,01). Важнейшим патогенетическим механизмом противостояния МБТ и макроорганизма является борьба за железо. Так, как ион железа необходим для биосинтеза супероксиддисмутазы (СОД) – ключевого фермента МБТ по защите ее от агрессивных радикалов кислорода генерируемых фагоцитами хозяина [3]. Как видим более эффективно это удается крысе, чем морской свинке, хотя и у крысы имеет место отчетливое снижение его количества в селезенке (табл. 1).

Таблица 1

Содержание железа в тканях морских свинок и крыс после заражения МБТ

* – достоверно отличающиеся от контроля результаты, (Р <0,01).

То есть, в любом случае, МБТ влияет на метаболизм железа в организме устойчивых и восприимчивых к туберкулезу животных, но в разной степени. Считается, что защита иона железа от использования его МБТ осуществляется его нитрованием оксидом азота [1].

Нами установлено, что у животных с различной видовой устойчивостью к МБТ генерация высокоактивных соединений азота (ВСА) в организме в ответ на заражение музейным штаммом МБТ – Н37 Rv значительно отличается. Так, у морских свинок количество конечного продукта окисления ВСА – нитрата в плазме крови возрастает после заражения от 56, ±11,2 мкмоль/л в контроле, до 88,8 ±10,5 мкмоль/л, то есть примерно в 1,6 раза (р < 0,01 к контролю). Тогда, как у крыс достоверного увеличения этого вещества к контролю не наблюдается (26,14 – 31,9 мкмоль/л, соответственно). Следует отметить, что морские свинки располагают большими ресурсами ВСА, о чём говорит 2х-кратное превосходство нитрата в плазме крови этих животных по сравнению с крысами (р <0,01).

Обращает на себя внимание, что у морских свинок так же гораздо более высокие показатели суммарных перекисей липидов определяемых по оксистату. Их содержание в крови у здоровых морских свинок 394,46 ±54,8 мкмоль/л., у зараженных – 609,53±143,40 (р< 0,01). У крыс его содержание 145,4±31,6 – 163,8 ± 18,8 мкмоль/л, соответственно, то есть, изменений после заражения практически не наблюдается (р> 0,05). Разница между морскими свинками и крысами по уровню суммарных перекисей в крови контрольных групп животных составила в 2 раза (р< 0,01). Но, после заражения МБТ, это различие становится почти 4х кратным. При чем у крыс увеличения показателей оксистата практически не наблюдается, а у морских свинок его уровень резко возрастает почти в 2 раза (p<0,01).

Нитрат является конечным метаболитом ВСА генерируемых эндотелием, фагоцитами, а оксистат – показатель конечных метаболитов превращения свободных радикалов кислорода – перекисей липидов. Эти метаболиты могут выполнять как регуляторно- защитную функцию, так и оказывать повреждающее воздействие на мембраны клеток и ткани при их высоких концентрациях в организме, например, при оксидативном стрессе [1].

Имеются данные, что при большом количестве ионов железа в тканях и низком уровне гидроперекисей в них железо выполняет антиоксидантные функции и наоборот- при низком уровне ионов железа и большом количестве гидроперекисей – прооксидантные [6,7]. Таким образом, замыкается порочный круг и МБТ навязывают необходимый им ритм метаболических процессов в макроорганизме, используя при этом его метаболические ресурсы. В частности большое количество железа для биосинтеза, например, антиоксидантного белка-фермента – бактериальной СОД [1,3].

В ферментных системах как макро- так и микроорганизмов железо входит в железо- серные комплексы. Поэтому острая борьба между МБТ и организмами подопытных животных разворачивается и за серу. Имеются данные, что у больных туберкулезом людей по мере прогрессирования заболевания с мочой начинает теряться все большее количество серосодержащих аминокислот [8]. Кроме того, есть данные что для МБТ необходимо большое количество тиолов (–SH групп), а вот окисленная сера (ионы SO3, SO4) для них неблагоприятна [2,9].

В наших исследованиях установлено, что после заражения количество сульфата (SO4) в печени морских свинок уменьшается почти в 2 раза с 498,8 мкг/г до 261, 9мкг/г (Р <0,01), а у крыс его количество было изначально больше, чем у морских свинок и после заражения еще увеличивается с 1246,4±345,1 мкг/г до 1447,4±276,7 мкг/г (P>0,05). То же самое касается и иона SO3, который присутствует в организме в виде таурина (NH2–СН3–СН2–SO3). Количество таурина в печени крыс после введения им МБТ резко увеличивается (с 525,2±28,9 мкг/г до 1657,5±425,1 мкг/г Р< 0,01) очевидно вследствие его усиленного биосинтеза из цистеина. Следует отметить, что таурина много в тканях крыс, особенно в кроветворных и лимфоидных. Так, в костном мозге крыс содержание таурина составляет 5859,1±620,4 мкг/г а у морских свинок – 468,7±71,1 мкг/г; в селезенке у крыс – 6105,1±245,1 мкг/г, а у морских свинок 902,0±58,1 мкг/г. Разница, как видим, в обоих случаях составляет почти на порядок (Р< 0,01). В костном мозге заражение МБТ подопытных животных приводит к следующим изменениям. Уровень таурина у крыс изменятся мало, зато увеличивается количество аргинина почти в 3 раза (Р< 0,01) и метионина от 0 до 51,0 мкг/г. Таурин, аргинин и метионин – метаболиты стимулирующие функционально – метаболическую активность фагоцитов [2, 8, 9, 10] и как установлено в наших исследованиях при увеличении этих метаболитов в костном мозге – у крыс усиливается моноцитарный росток кроветворения (табл. 2).

Таблица 2

Содержание свободных аминокислот костного мозга морских свинок и крыс после заражения МБТ (мкг/г ткани)

* – достоверно отличающиеся от контроля результаты, (Р<0,05).

Результаты наших исследований подтверждают гипотезу что, усиление функционально – метаболических возможностей фагоцитов, очевидно, и препятствует развитию туберкулезного процесса [3,6].

МБТ изгоняются из организма крыс через несколько месяцев после их введения без признаков специфического инфекционного процесса при усилении клеточного звена иммунитета [2,4].

Морские свинки так же пытаются после заражения МБТ увеличить количество таурина в костном мозге (увеличение почти в 3 раза) (Р <0,01), но это увеличение все равно далеко не дотягивает до того уровня что имеется у крыс. Кроме того морские свинки увеличивают в костном мозге уровень глутаминовой кислоты и аланина. Но эти метаболиты являются стимуляторами лимфоидного звена кроветворения [10], что очевидно неэффективно при туберкулезной инфекции. У крыс, напротив, количество глутамата и аланина в костном мозге уменьшается, что в целом свидетельствует о значительно более рациональных защитно- адаптивных перестройках в кроветворных органах и иммунной системе крыс после введения им МБТ, чем у морских свинок. Это положение подтверждается изменениями в ростках кроветворения подопытных животных (табл. 3).

У морских свинок происходит стимуляция гранулоцитарного ростка кроветворения тогда, как эритроцитарный, моноцитарный, лмфоцитарный подавляются (во всех случаях Р< 0,05). У крыс отмечается отчетливое стимулирование моноцитарного ростка. При этом гранулоцитарный и лимфоидный существенных изменений к контролю не проявляют. Обращает на себя внимание, что угнетается эритроцитарный росток кроветворения примерно на 30 % (Р< 0,05).

Таблица 3

Соотношение ростков кроветворения в костном мозге морских свинок и крыс после заражения МБТ ( в % к общему количеству клеток)

* – достоверно отличающиеся от контроля (интактные животные) результаты (Р<0,05).

У крыс, как мы уже отмечали, после введения им МБТ специфический туберкулезный процесс не развивается, но, тем не менее, борьба с введенными микроорганизмами продолжается и наиболее остро она идет за ресурсы железа и серы. Крысы располагают гораздо большими ресурсами сульфата в отличие от морских свинок, они имеют более мощную грубоволокнистую соединительную ткань богатую сульфатом [4]. Как видим мобилизация окисленной серы в виде сульфита и сульфата в печени крыс препятствует значительному истощению железа в организме крыс после введения им МБТ. Но, в следствие борьбы с внедрившимися МБТ все же некоторое истощение этих ресурсов наблюдается и у крыс. В частности резкое снижение количества железа в селезенке (табл. 1) и некоторое угнетение образования эритроцитов (табл. 3). Но особенности метаболизма крыс позволяют им резко мобилизовать клеточно-фагоцитарное звено иммунитета и подавить МБТ с последующим их изгнанием из организма.

Ранее мы публиковали сведения о том, что крысы на введение МБТ усиливают биосинтез аскорбиновой кислоты (АК) и таурина в печени [4] с одновременным возрастанием уровня таурина, глутатиона восстановленного, аргинина, активных форм кислорода (АФК) в лейкоцитах и плазме крови. То есть, усиливается метаболическая активность фагоцитов, но их функциональная активность возрастает в меньшей степени. АК, глутатион восстановленный, аргинин и таурин мощные стабилизаторы мембран и антиоксиданты [1,7,8,9] что, очевидно, и позволяет резко усилить генерацию АФК в фагоцитах и уничтожить введенные МБТ на метаболическом уровне без существенного перенапряжения иммунной системы. У морских свинок после заражения отмечается угнетение фагоцитов крови, как на функциональном так и на метаболическом уровне [2,5]. В костном мозге угнетается эритроцитарный и моноцитарный ростки кроветворения усиливается гранулоцитарный. При этом, в кроветворной ткани увеличивается содержание глутаминовой кислоты и аланина. Показательно, что в костном мозге крыс после заражения общая сумма аминокислот уменьшается с 12042,6 мкг/г до 8377,5 мкг/г, тогда как у морских свинок увеличивается с 3066,3мкг/г до 4089,2 мкг/г. Уровень полиаминов возрастает у первых от 218,4 нмоль/г до 386,5 нмоль/г, а у вторых снижается с 186,4 нмоль/г до 98,5 нмоль/г (во всех перечисленных случаях различие достоверно – р <0,01). Отмеченные различия свидетельствуют о том, что в кроветворной ткани крыс усиливаются анаболические процессы, а у морских свинок катаболические.

Ранее мы отмечали, что в печени морских свинок после заражения МБТ содержание АК и таурина уменьшаются, но при этом усиливается образование глутатиона и происходит резкое его окисление [2]. Уровень окисленного глутатиона и оксида азота возрастает в плазме и лейкоцитах крови. Окисленный глутатион, аргинин и оксид азота – мощные стимуляторы апоптоза [ 3]. Очевидно, апоптоз является главной стратегией защиты морских свинок после заражения их МБТ, но это не спасает морскую свинку от генерализации туберкулезного процесса и скорой гибели, тогда как крысы обеспечивают эффективную перестройку защитно-адаптивных механизмов и изгоняют через несколько месяцев введенные МБТ из организма.

Заключение

Таким образом можно констатировать тот факт, что ионы железа, серы (сульфат и сульфит), аскорбиновая кислота, таурин, глутатион восстановленный , аргинин, метионин являются факторами повышающими естественную резистентность к туберкулезу в то время как стимуляторы апоптоза- глутатион окисленный, оксид азота, глутамат, аргинин повышают чувствительность организма к туберкулезной инфекции. Различные сочетания метаболитов, повышающих естественную резистентность к МБТ, могут быть использованы в патогенетической терапии туберкулеза.