Трудности идентификации этой структуры состояли не только в том, что она имела одинаковую электрофоретическую подвижность (ЭФП) с IgG - старт 7,5% полиакриламидного геля (ПАГ) в неденатурирующих условиях электрофореза (н-ПАГЭ), но и в том, что IgG также являлся одним из 3-х белков комплекса, который представлял собой ГФП (Prokopenko P.G. et аl., 2007). ГФП асцита включал IgG, сывороточный альбумин (СА) и неизвестный протеин (протеин Х), неидентичный IgG и альбумину. Комплекс протеинов ГФП окрашивался на глико- и ферропротеины, обладал пероксидазной активностью (ПА), реагировал с моноклональными и поликлональными антителами (МАТ и ПАТ) к «антигену СА 125» (СА125). IgG не обладал этими свойствами и был неидентичен ГФП, но главное - ГФП реагировал со всеми коммерческими (ком.) антисыворотками к белкам сыворотки доноров (анти-СД) в реакции преципитации. После абсорбции анти-СД сывороткой крови здоровых людей - антисыворотки теряли реактивность, что указывает на сывороточную природу ГФП (Prokopenko P.G., 2006).
ГФП асцита диссоциировал с образованием множественных промежуточных форм, основные из которых имели ЭФП альфа- и бета-глобулинов с МВ ~ 230 (А230) и ~ 110 кДа (В110). После прогревания (100о х15 мин) альфа-формы с МВ 230 кДа, сохранялась иммунореактивная структура с МВ 73,6 кДа, которая была представлена двойным комплексом - «термостабильный протеин Х - альбумин».
Конечная форма диссоциации ГФП при электрофорезе с додецилсульфатом натрия (ДСН) в ПАГ (ДСН-ПАГЭ) представлена единственной белковой полосой с МВ 55 кДа; в восстанавливающих условиях (ДСН-МЭ-ПАГЭ) тоже одной полосой, но с МВ 75 кДа (Freiles M.T. et al., 1993; Prokopenko P.G.et al., 2007). Эта форма также представляла комплекс 3-х неидентичных полипептидов (КП55), который включал термостабильный протеин-Х и структуры, идентичные СА и тяжелым цепям - heavy chain (HC) IgG (IGHC). ЭФП КП55 соответствовала ЭФП СА, т.е., комплекс мигрировал в проекции альбуминов и никогда не выходил из его «тени». В реакции преципитации КП55 реагировал только с поликлональными антисыворотками к СА125 и к белкам сыворотки здоровых людей, абсорбированными СА и IGHC, но никогда не связывал м-МАТ к СА125, не окрашивался на глико- и ферропротеины, не проявлял ПА, но после абсорбции анти-СД сывороткой доноров - анти-СД теряли реактивность, что также подтверждает сывороточную природу КП55 (Prokopenko P.G. et al., 2003).
Термостабильный протеин-Х асцита настолько прочно сцеплен с альбумином, что его не удалось отделить от альбумина даже после длительного прогревания (100о х 30 мин) и он назван «термостабильным протеином, сцепленным с альбумином» - ТПС.А. Двойной комплекс «ТПС.А - альбумин» обнаружен после прогревания во всех диссоциативных изоформах ГФП, включая конечную, и все они имели иммунохимические аналоги в сыворотке здоровых людей. Из этого следует, что комплексы и фрагменты альбумина сыворотки могут быть обнаружены в любой зоне ПАГЭ и самого различного молекулярного веса. Из множества подобных свидетельств мы приведем лишь некоторые: известен «альбумин-IgG комплекс» (Sharma N.C. et.al., 1981); в плазме человека обнаруживали 8 комплексов и фрагментов СА с МВ 210, 168, 147, 132, 110, 45, 28 и 19 кДа (Bharati K. еt al., 1984), а в моче еще больше - 9 структур с МВ 260, 180, 110, 45, 40, 30, 24, 18 и 11 кДа (Roger C. еt al., 1985).
Изучение сыворотки здоровых людей мы начали с того, что повторили исследования 70-х годов и подтвердили их результаты: макроглобулин на старте 7,5% н-ПАГ окрашивался на ферро- и гликопротеины. Более того, альбумины человека, быка и крысы, выделенные ex tempore из сыворотки, демонстрировали на старте н-ПАГЭ ферропротеин с ПА. При этом IgG - белок этой же зоны, оставался неактивным. В дальнейшем исследования сошлись в точку альбуминов. Во всех препаратах СА обнаружен протеин, который был иммунохимически идентичен ТПС.А асцита. После прогревания сывороточного альбумина ТПС.А в нём составлял до 1,5% от белка, который сохранял свою идентичность, но оставался в комплексе с СА; IGHC денатурировали полностью. Показано, что ТПС.А сыворотки неидентичен CA и IGHC. Следует особо отметить, что ТПС.А асцита и сыворотки реагируют только с поликлональными антисыворотками к ГФП500, КП55 и с любыми коммерческими анти-СД человека после истощения антител к альбумину и IGHC; c м-МАТ к антигену СА125 - КП55 и ТПС.А никогда не реагировали.
Выделенные из СД - ГФП и ТПС.А в СДС-ПАГЭ мигрируют в зоне альбуминов одной полосой с МВ ~ 42 кД, в СДС-МЭ-ПАГЭ также одной полосой, но с МВ ~ 62 кД. Феномен возрастания молекулярного веса белка ~ на 20 кД, стабильно демонстрируют: нативные альбумины человека, быка и крысы; а также прогретые и ренатурированные альбумины человека и быка. С IgG и АФП мы этого феномена не наблюдали.
Антиген ТПС.А (всегда в комплексе с альбумином) обнаружен во всех биологических жидкостях больных и здоровых людей, во всех испытанных образцах альбуминов человека, включая коммерческие, а также в коммерческих IgG, анти-IgG (Россия) и в антисыворотке к тяжелым цепям иммуноглобулинов - G, A, M (Bio-Rad, USA).
Антитела к ТПС.А обнаружены во всех наших антисыворотках к биологическим жидкостям больных и во всех коммерческих анти-СД сыворотках (Binding Site Limited, UK; Sigmа, USA; Россия).
Отсюда следует, что ТПС.А - типичная сывороточная структура, но, тщательно скрытая в тени альбуминов, по-видимому, является неизвестным белком. В то же время мы полагаем, что первичная структура ТПС.А может быть известной и, возможно, представлена в повторяющихся мотивах экстрацеллюлярного домена антигена СА125 с 421 по 524 и с 641 по 742 а.о. (Brain T.J. et al., 2001), а возможный МВ этого мотива ~ 11 кД, не противоречит и нашим расчетам.
Уникальная связывающая способность альбумина общеизвестна. Однако, некоторые структурно-функциональные несоответствия в «поведении» альбумина, особенно демонстративные в настойчивых попытках использовать гиперочищенные препараты альбуминов, позволяют усомниться в антигенной «моновалентности» препаратов альбумина и указывают на иной источник этих несоответствий, которым и может быть двойник альбумина - его комплекс с ТПС.А, а наличие в пространственной структуре альбумина потенциальных гнёзд для посадки ТПС.А - 3 солидные впадины, не позволяет это исключить.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского гуманитарного научного фонда (грант № 09-06-00241а).
Библиографическая ссылка
Прокопенко П.Г., Терентьев А.А. ИЗУЧЕНИЕ ДИССОЦИАТИВНЫХ ФОРМ IgG-ПОДОБНОЙ СТРУКТУРЫ АСЦИТОВ И СЫВОРОТКИ КРОВИ // Международный журнал экспериментального образования. – 2010. – № 7. – С. 55-57;URL: https://expeducation.ru/ru/article/view?id=506 (дата обращения: 03.12.2024).