Научный журнал
Международный журнал экспериментального образования
ISSN 2618–7159
ИФ РИНЦ = 0,839

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ

Адиева А.А. 1 Меджидова М.Г. 1 Магомедова П.Т. 1 Израилова Г.Р. 1
1 Дагестанский университет народного хозяйства (ДГУНХ)
1. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации №02.030-08, Роспотребнадзор. – М, 2008. – С.20.
2. Климова Р.Р., Масалова О.В., Атанадзе С.Н., Кущ  А.А. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу герпеса 1 и 2 типа // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол.– 1999. – №5. – C. 99-103.
3. Макарова Н.Е., Кущ А.А., Иванова Л.А., Мартынова В.Н., Баринский И.Ф., Pustowoit B. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток // Вопр.вирусол. – 1996, Т. 41. – № 1. – С. 28-32.
4. Адиева А.А., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия  Е.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Выжлова Е.Н., Климова Р.Р., Федорова Н.Е., Малиновская В.В., Кущ A.A. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных детей в неонатальном периоде // Педиатрия. – 2008. – №3. – С.134-144.1. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации №02.030-08, Роспотребнадзор. – М, 2008. – С.20.
2. Климова Р.Р., Масалова О.В., Атанадзе С.Н., Кущ  А.А. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу герпеса 1 и 2 типа // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол.– 1999. – №5. – C. 99-103.
3. Макарова Н.Е., Кущ А.А., Иванова Л.А., Мартынова В.Н., Баринский И.Ф., Pustowoit B. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток // Вопр.вирусол. – 1996, Т. 41. – № 1. – С. 28-32.
4. Адиева А.А., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия  Е.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Выжлова Е.Н., Климова Р.Р., Федорова Н.Е., Малиновская В.В., Кущ A.A. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных детей в неонатальном периоде // Педиатрия. – 2008. – №3. – С.134-144.

В настоящее время активно изучается роль системы естественного иммунитета в развитии ответа на патогены при вирусных инфекциях у беременных женщин, связи с возможным внутриутробным инфицированием плода, а также у новорожденных детей. Моноинфекции как у беременных женщин, так и у новорожденных встречаются довольно редко. Частота сочетанных форм может достигать по различным данным, 70-80 %. Как и следовало ожидать, одновременное присутствие в организме нескольких возбудителей приводит к усилению вирулентных свойств каждого из них, к проявлению клинически нетипичной картины.

Внутриутробное инфицирование герпесвирусами обнаруживается в 0,4-2,3 % новорожденных. Эти инфекции являются частой причиной смертности новорожденных, заболеваемости в перинатальном периоде и отдаленных поражений разных органов и систем.

Исход внутриутробной инфекции (ВУИ) в значительной степени определяется врожденным иммунитетом, который у недоношенных новорожденных детей в настоящее время остается недостаточно изученным. В настоящей работе проведено комплексное исследование цитокинов совместно со специфическим гуморальным ответом к вирусу простого герпеса и цитомегаловирусу в сыворотке крови, что представляется актуальным, так как может иметь диагностическую и прогностическую значимость при подозрении на внутриутробное инфицирование плода.

Методы исследования

Пациенты. Обследованы 127 новорожденных детей, родившихся в специализированном акушерском отделении ГБ№8 Департамента здравоохранения г. Москвы. Основными объектами исследования служили периферическая кровь и моча, по показаниям – ликвор. Для изучения интерферонового и цитокинового статуса образцы крови транспортировали в лабораторию онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (рук. лаб.– профессор, д.м.н. Малиновская В.В.). Для анализа прямых и непрямых маркеров ВПГ и ЦМВ образцы крови, мочи и ликвора транспортировали в лабораторию клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (рук. лаб. – профессор, д.б.н. Кущ А.А.).

Интерфероновый статус. Для оценки интерферонового статуса проводили количественный анализ циркулирующих ИНФ-α и ИФН-γ в сыворотках крови пациентов, а также спонтанную (базисную) и индуцированную продукцию цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) лейкоцитами периферической крови in vitro методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем ProCon IF2plus (С.-Петербург) и Biosource IFNg ( 5;L38O) на ридере Anthos В качестве индукторов использовали: для ИФН-α – вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для ИФН-γ – ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения ИФН-α составляла 5 пкг/мл, для определения ИФН-γ – 3 пкг/мл.

Полимеразная цепная реакция. ДНК ВПГ и ЦМВ определяли методом ПЦР в классическом форезном варианте и real time с помощью сертифицированных коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия). Выделение вирусной ДНК ВПГ и ЦМВ производили с помощью наборов: «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», для ПЦР-амплификации использовали комплект реагентов «АмплиСенс ЦМВ; АмлиСенс CMV-Fl» и «АмплиСенс ВПГ 1,2 типов; АмлиСенс HSV 1,2-Fl». Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) и IQ циклера фирмы «Biorad» согласно рекомендации производителя тест-систем.

Быстрый культуральный метод. БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [1]. Детекцию ВПГ проводили с помощью моноклональных антител (МКА) [2]. Для обнаружения белков ЦМВ использовали МКА к ЦМВ [3]. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [4].

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение специфических антител к ЦМВ и ВПГ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие наборы фирмы «Диагностические системы» (Россия). Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М» и «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ1,2-М», для выявления антител класса IgG «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» и «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ1,2-G». Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG к ЦМВ и ВПГ определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность» и «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ1,2-G Авидность» («Диагностические системы», Россия). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений – критерий Вилкоксона. Частоту встречаемости маркеров врожденных инфекций анализировали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Пациенты на первом этапе были разделены на 2 группы: 1 – дети, у которых отсутствовали прямые маркеры ВПГ и ЦМВ (ДНК, экспрессия ранних и поздних белков) и 2 – дети, со смешанной ВПГ и ЦМВ инфекцией. По совокупности двух методов (ПЦР, БКМ) маркеры сочетанной (ВПГ+ЦМВ) инфекции хотя бы в одном из исследованных материалов были найдены у 16 детей. В этой группе IgM антитела к ЦМВ выявлены у одного ребенка. У 5 из 16 новорожденных детей при первичном обследовании антитела класса IgG не выявлены или их концентрация в крови ниже чувствительности тест-системы. У 10 (62,5 %) детей, выявленные антитела класса IgG оказались с низким или промежуточным индексом авидности. Следует отметить, что и активность специфических антител в этой группе была значительно ниже, чем в группе здоровых детей. Учитывая, что все дети были обследованы до 10 суток после рождения, это указывает на смешанное внутриутробное инфицирование, при котором у детей в значительной степени подавлен В-клеточный ответ.

У 36 детей маркеры смешанной инфекции не обнаружены. В этой группе антитела класса IgG отсутствовали только у одного ребенка, что было достоверно ниже, чем в первой группе (Р=0.006). Антитела класса IgG с низким или промежуточным индексом авидности выявлены у 16 (44,4 %) новорожденных ребенка, что также несколько меньше, чем в первой группе. В группе без маркеров ВУИ в основном преобладали антитела IgG класса с индексом авидности больше 0,7. При сравнении суммарного содержания количества отрицательных, низкоавидных и с промежуточной авидностью проб в двух группах, различия оказались высоко достоверны (Р=0.002).

В связи с различиями гуморального ответа показалось интересным определить уровни провоспалительных цитокинов в этих группах. Показатели исследуемых интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) у здоровых детей были значительно ниже аналогичных показателей в группе детей со смешанной инфекцией.

При анализе цитокинов, основными клетками – продуцентами которых являются макрофагальные клетки, было установлено, что содержание ИЛ-1 в сыворотке у здоровых детей 2-ой группы (м=900 пкг/мл) было в 6,6 раза ниже по сравнению с детьми 1-ой группы (м=6000 пкг/мл), а содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке детей с вирусной инфекцией было в 10-20 раз выше от уровня этих цитокинов в сыворотке здоровых детей. Достоверно значимым оказалось выявление сывороточного ИЛ-6 (м=1800 и м=39000 пкг/мл, соответственно). Таким образом, у детей со смешанной герпесвирусной инфекцией отмечено увеличение выработки провоспалительных цитокинов.

В сыворотке у здоровых детей определена более высокая концентрация спонтанного и индуцированного ИФН-γ (м=160000 и м=190000 пкг/мл) по сравнению с новорожденными с ВПГ и ЦМВ (м=30000 и м=40000 пкг/мл, соответственно).


Библиографическая ссылка

Адиева А.А., Меджидова М.Г., Магомедова П.Т., Израилова Г.Р. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ // Международный журнал экспериментального образования. – 2015. – № 12-2. – С. 211-213;
URL: https://expeducation.ru/ru/article/view?id=9046 (дата обращения: 19.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074