Научный журнал

Международный журнал экспериментального образования

ISSN 2618–7159

ИФ РИНЦ = 0,425

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ковалева М.А. 1 Макарова М.Н. 1 Горячева М.А. 1 Гущин Я.А. 1 Макаров В.Г. 1 Хомутников Е.А. 2

---

1 ЗАО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»

2 ФКУЗ «1 военный госпиталь внутренних войск министерства внутренних дел России» Министерства внутренних дел Р.Ф.

Ежегодно количество пациентов с диагнозом сахарный диабет возрастает. Ангиопатии и нейропатии по-прежнему являются ведущими осложнениями данной патологии, которые приводят к инвалидизации пациента. В связи с чем, моделирование диабетических осложнений на экспериментальных животных является актуальной задачей. В статье обсуждены основные методологические подходы формирования экспериментальной модели «диабетической стопы» на фоне длительно текущего стрептозотоцин-индуцированного диабета. Проведена оценка развития микроангиопатий и нейропатий с применением биохимических и гистологических методов. Установлено, что 14 недель течения экспериментального стрептозотоцин-индуцированного диабета достаточно для формирования сосудистых осложнений, а также изменений в тканях периферических нервов. Модель может быть рекомендована для проведения доклинических исследований, с целью выявления ангио- и нейропротекторных эффектов противодиабетических препаратов.

Статья в формате PDF

0 KB

экспериментальный диабет

«диабетическая стопа»

микроангиопатия

нейропатия

глюкоза

1. Доскина, Е.В. Причины неудач в компенсации пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Роль постпрандиальной гликемии // Сахарный диабет. – 2010. – № 1. – С. 129–135.

2. Кондратьев Я.Ю., Носиков В.В., Дедов И.И. Полиморфные генетические маркеры и сосудистые осложнения сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. – 1998. – Т. 44. № 1. – С. 43–51.

3. Маслова О.В., Сунцов Ю.И. Эпидемиология сахарного диабета и микрососудистых осложнений // Сахарный диабет. 2011. – №3. – С. 6–12.

4. Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. Аллоксановый диабет // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. – 2013. – № 3. – С. 26–29.

5. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности гистологической обработки органов и тканей лабораторных животных // Международный вестник ветеринарии. – 2014. – №2. – С.103–109.

6. Погорелов В.М., Медовый B.C., Балабуткин В.А. и др. Методы компьютерной цитологии в гематологических исследованиях // Клиническая лабораторная диагностика. – 1997. – № 11. – С. 40– 44.

7. Пятницкий A.M., Соколинский Б.З., Бетрозова М.В. и др. Анализ эритроцитов в системе МЕКОС-Ц // Клиническая лабораторная диагностика. – 1997. – №10. – С. 8–9.

8. Спасов А.А., Воронкова М.П., Снигур Г.Л., Чепляева Н.И., Чепурнова М.В. Экспериментальная модель сахарного диабета типа 2 // Биомедицина. – 2011. – № 3. – C. 12–18.

9. Bessis M., Mochendas N. Blood Cells // Hematology. – 1975. Vol. 1. – P. 315–321.

10. Chatzigeorgiou A., Halapas A., Kalafatakis K., Kamper E. The use of animal models in the study of diabetes mellitus // In Vivo. – 2009. Vol. 23. – P. 245–258.

11. Etuk E.U. Animals models for studying diabetes mellitus // Agriculture and Biology Journal of North America. – 2010. – Vol. 1 (2). – P. 130–134.

12. Hirsch T., Spielmann M., Zuhaili B. et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model // BMC Surgery. – 2008. Vol. 8(5). – P.1–8.

13. Mendes J., Leandro C, Bonaparte D. et al. A Rat Model of Diabetic Wound Infection for the Evaluation of Topical Antimicrobial Therapies // Comparative Medicine. – 2012. Vol. 62 (1). – P.37–48.

14. Okamato H. Regulation of proinsulin synthesis in pancreatic islets and a new aspect to insulin dependant diabetes // Molecular Cell Biochemistry. – 1981. – N 37. – Р. 43–61.

На сегодняшний день сахарный диабет является достаточно изученной патологией, существует множество лекарственных препаратов и современных схем терапии данного заболевания, однако, болезнь продолжает прогрессировать особенно в развитых странах [4]. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, количество пациентов с диагностированным сахарным диабетом составляет около 160 млн., к 2025 г. прогнозируется удвоение количества пациентов с этим диагнозом. Следует отметить, что диабет является социально значимым заболеванием, поскольку сосудистые осложнения приводят к ранней инвалидизации пациентов и летальности [1, 3]. Одним из осложнений диабета является синдром «диабетической стопы». При данном состоянии наблюдается комплекс анатомо-функциональных изменений на фоне длительной гипергликемии, приводящей к развитию нейропатии, микро- и макроангиопатий, остеоартропатии, что приводит к повышенной травматизации и инфицированию мягких тканей стопы. В связи с чем, разработка мероприятий (в том числе фармакологической терапии), направленных на снижение возникновений осложнений при диабете является актуальной задачей.

Большое значение для определения вопросов патогенеза, клиники и терапии заболевания имеет экспериментальная диабетология. Экспериментальные модели диабета и его осложнений позволяют получить важные сведения не только для понимания патофизиологии заболевания, но и механизма антидиабетического действия лекарственных препаратов с целью их направленного применения [8, 10]. К настоящему времени разработан ряд моделей экспериментального диабета [11], основными из которых являются: хирургическая (полное или частичное удаление поджелудочной железы); химическая модель (используется введение химических веществ, избирательно воздействующих на b-клетки островков: аллоксан, стрептозотоцин), генетические модели (получение трансгенных животных). Моделирование «диабетической стопы», как правило, проводится на фоне стрептозотоцин-индуцированного диабета с принудительным инфицированием лапы Синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa) и Золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus) [12, 13].

Целью данной работы стала разработка неинфекционной экспериментальной модели «диабетической стопы», с развитием ангио- и нейропатии.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на 30 крысах-самцах популяции линии Wistar, полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово».

Кормление животных осуществлялось стандартным полнорационным гранулированным комбикормом приготовленным по ГОСТ Р 50258–92. Доступ к воде и корму был свободный. Крыс-самцов содержали в поликарбонатных клетках по 5 особей, при температуре 20–22°С. Содержание животных осуществлялось в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) и Приказом Минздравсоцразвития РФ №708н от 23.09.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные были разделены на контрольную (n=15) и опытную группы (n=15).

Формирование экспериментальной патологии у животных опытной группы проводили введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг однократно внутрибрюшинно, спустя 15 минут после введения никотинамида (Sigma, США) в дозе 230 мг/кг (внутрибрюшинно).

С целью выявления биохимических и гистологических признаков диабета и его поздних осложнений у экспериментальных животных были проведены исследования в динамике. Концентрацию глюкозы в периферической крови измеряли глюкометром OneTouch Horizоn («Lifescan», США). Линейный диапазон измерения 1,1 – 33,3 ммоль/л. Гликозилированный гемоглобин (HbA1c) в крови определяли с использованием набора «Диабет-тест» (Фосфосорб, Россия). Метод основан на аффинной хроматографии гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина в гемолизате крови. Линейный диапазон измерения 2,0 – 20,0 %. Подсчет ретикулоцитов проводился согласно унифицированной методике после их окраски готовым красителем – бриллиантовым крезиловым синим (Диахим-ГемиСтейн-РТЦ) в пробирке (суправитальный пробирочный метод).

Для гистологического и иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина в течение 24 часов, и по общепринятой методике заливали в парафин [5]. Затем изготавливали срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение экспрессии нейронального маркера PGP 9.5 с использованием моноклональных антител производства фирмы Abcam. Постановка реакции проводилась непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB (Labeled streptavidin–Biotin, DakoCytomation, LSAB 2 System – HRP) методом визуализации; выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью 3,3–диаминобензидина, препараты докрашивали гематоксилином Майера. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа CarlZeiss (Германия). Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры AxioScopeA1 (Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

Как известно механизм действия стрептозотоцина связан с наличием в его химической структуре сахарозного остатка (гексозы), за счет которого, через транспортную систему ГЛЮТ-2, он включается β-клетками островков Лангерганса в обменные процессы вместо глюкозы. Попадая в клетку, стрептозотоцин разрушается с образованием свободных радикалов и NO·, в результате происходит алкилирование ядерной ДНК и гибель клетки [14]. Предварительное введение никотинамида приводит к снижению диабетогенного действия стрептозотоцина.

В ходе исследования было установлено, что спустя 5 недель у животных опытной группы наблюдали клинические проявления диабета, которые нашли отражение в статистически значимом увеличении концентрации глюкозы по отношению к контрольным животным более чем в 4 раза (рис. 1).

К концу исследования (14 неделя) у животных опытной группы сохранялась гипергликемия, которая дополнительно сопровождалась статистически значимым увеличением концентрации гликозилированного гемоглобина (HbA1c) более чем в 2 раза (7,4±0,1 %). Увеличение концентрации HbA1c характерно для течения гипергликемии, длительность имеет положительную корреляцию с частотой развития осложнений при диабете. Данный показатель отражает риск развития осложнений диабета.

Спустя 10 и 14 недель после моделирования экспериментального стрептозотоцин-индуцированного диабета у животных опытной группы наблюдали статистически значимое увеличение уровня ретикулоцитов более чем в 3 раза (табл. 1).

Рис. 1. Динамика изменения концентрации глюкозы в периферической крови крыс-самцов, ммоль/л

Таблица 1

Уровень ретикулоцитов в крови крыс-самцов, спустя 10 и 14 недель развития патологии, M±m (n=15)

* – различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

На фоне хронического диабета в тканях возникает дефицит кислорода и компенсаторно происходит увеличение эритропоэза [6, 7], что сопровождается выходом в системный кровоток молодых эритроцитов и ретикулоцитов. Уровень ретикулоцитов в периферической крови при окислительном стрессе отражает степень гипоксии тканей [2, 9].

Гистологическая оценка подтвердила наличие изменений характерных для диабетической патологии. В опытной группе наблюдали типичные проявления микроангиопатии, характерные для отсроченных осложнений диабета (рис. 2–6). У животных данной группы наблюдали продуктивный капиллярит со слабо выраженным периваскулярным склерозом, а также склероз стенок артериол. В тканях выявляли периваскулярную лимфо-гистиоцитарную инфильтрацию от слабой до умеренной выраженности, частично затрагивающую периневральные зоны. Кроме того была выявлена аксональная дегенерация, демиелинизация и очаговый некробиоз аксонов. Трофические нарушения приводили к дистрофическими нарушениям в дерме, где отмечался выраженный гиперкератоз и слабо выраженный акантоз, местами с вовлечением в процесс придатков кожи (волосяных фолликулов, сальных и потовых желез). Патологический процесс частично затрагивал костно-суставную структуру в виде дистрофических изменений хрящевой ткани. В тканях крыс-самцов контрольной группы отличий от нормы не выявлено.

Рис. 2. Аксональная дегенерация и очаговый некробиоз аксонов в нервном стволе. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200

Рис. 3. Умеренно выраженная диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация, преимущественно переваскулярных и переневральных зон, соединительнотканные «муфты» в переневральных зонах (стрелка). Увеличение 200

Рис. 4. Выраженный гиперкератоз и слабо выраженный акантоз, вовлечение в патологический процесс придатков кожи (волосяных фолликулов). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200

При иммуногистохимическом исследовании с применением маркера PGP 9.5 в опытной группе крыс-самцов наблюдали диабетическую нейропатию, которая выражалась в снижении плотности нервных волокон за счет аксональной дегенерации, демиелинизации и очагового некробиоза (рис. 5). В контрольной группе животных отличий от нормы не выявлено (рис. 6).

Рис. 5. Кожа стопы крысы контрольной группы. Нервные волокна без отклонения от нормы. Иммуногистохимическое окрашивание. Экспрессия нейронального маркера PGP 9.5 в осевых цилидрах. Увеличение 200

Рис. 6. Кожа стопы крысы опытной группы. Нервные волокна с очагами демиелинизации, дегенерации тигроидной субстанции осевых цилиндров. Иммуногистохимическое окрашивание. Снижение экспрессии нейронального маркера PGP 9.5 в осевых цилидрах. Увеличение 200

Таким образом, данные гистологического и иммуногистохимического исследования подтверждают развитие ангио- и нейропатий у лабораторных животных.

Выводы

Биохимические исследования крови лабораторных крыс-самцов с модельной патологией стрептозотоцин-индуцированного диабета выявили стойкие изменения углеводного обмена (гипергликемия (концентрация глюкозы в крови опытных животных находилась в диапазоне 17–23 ммоль/л), повышение концентрации HbA1 (в два раза по сравнению с контрольной группой)), увеличение уровня ретикулоцитов более чем в 3 раза, свидетельствующие о развитии диабета у животных.

Спустя 14 недель исследования у лабораторных животных определяются структурно-морфологические изменения, свидетельствующие о развитии ангио- и нейропатии.

Модель длительно-текущего стрептозотоцин-индуцированного диабета может быть рекомендована для изучения специфической активности новых препаратов, для терапии отсроченных осложнений диабета.

Библиографическая ссылка