Научный журнал
Международный журнал экспериментального образования
ISSN 2618–7159
ИФ РИНЦ = 0,839

СВЯЗЬ МУТАЦИЙ ГЕНА KRAS С КЛИНИКО-ПАТОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА У ПАЦИЕНТОВ ЮГА РОССИИ

Водолажский Д.И.,1Антонец А.В. 1 Двадненко К.В. 1 Владимирова Л.Ю. 1 Геворкян Ю.А. 1 Касаткин В.Ф. 1 Максимов А.Ю. 1
1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
Проведен анализ взаимосвязи мутаций гена KRAS с клинико-патологическими особенностями колоректального рака у пациентов Юга России. Учитывались пол, возраст, локализация первичной опухоли, степень дифференцировки опухолевых клеток, наличие метастазов в печень, регионарные и отдаленные лимфоузлы, стадия заболевания у пациентов с мутантным и диким типом гена KRAS. В исследовании анализировали частоты 7 SNP-мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS. Выявлены статистически значимые ассоциации мутантного типа гена KRAS с полом и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах.
колоректальный рак
мутации KRAS
Юг России.
1. Беляева А.В. Мутации в гене K-ras у больных колоректальным раком: эпидемиология и клиническое значение: автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Санкт-Петербург, 2012. – 23 с.
2. Владимирова Л.Ю. оценка эффективности и токсичности моноклонального антитела к EGFR панитумумаба при колоректальном раке / Владимирова Л.Ю., Геворкян Ю.А., Абрамова Н.А. и др. // VII съезд онкологов и радиологов стран СНГ. – 2012.
3. Capella G, Cronauer-Mitra S, Pienado M.A., et al: Frequency and spectrum of mutations at codons 12 and 13 of the c-KRAS gene in human tumours. Environ Health Perspect 1991; 93: 125 –131.
4. Cerottini J.P. The type of KRAS mutation determines prognosis in colorectal cancer / Cerottini J.P., Caplin S., Saraga E., et al. // Am J Surg. – 1998. – Vol. 175. – P. 198 –202.
5. Hughes R. Dosedependent effect of dietary meat on endogenous colonic N-nitrosation // Carcinogenesis. – 2001. – Vol. 22. – P. 199 – 202.
6. Jemal A. Global cancer statistics // CA Cancer J Clin. – 2011. – Vol. 2. – № 61. – Р. 69-90.
7. Lee W.S. Mutations in KRAS and epidermal growth factor receptor expression in Korean patients with stages III and IV colorectal cancer / Lee W.S. Baek J.H., Lee J.N., et al. // Int J Surg Pathol. – 2011. – Vol.19. – P. 145 – 151.
8. Samadder N. Cigarette Smoking and Colorectal Cancer Risk by KRAS Mutation Status Among Older Women / Samadder N., Vierkant R., Tillmans L. et al. // Am J Gastroenterol. – 2012. – №5. – Vol.107. – Р. 782-789.
9. Samowitz W.S. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumour location, stage, and survival: a population-based study / Samowitz W.S., Curtin K., Schaffer D., et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2000. – №9. – P. 1193 – 1197.
10. Vladimirova L.Y. Resilts of monoclonal antibodies against EGFR-receptors application in patients with metastatic colorectal cancer / Vladimirova L.Y., Kit O.I., Nikipelova E.A. et al. // J Clin Oncol. 49th Annual Meeting of ASCO. – 2013. – №15 (suppl.). – Vol. 31. – P. 800S. e19047.

Введение

Колоректальный рак (КРР) занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и смертности в развитых странах мира, выходя на третье место у мужчин и второе – у женщин [1, 6]. Рассматривая структуру заболеваемости раком среди мужского населения России, следует отметить, что злокачественные опухоли ободочной и прямой кишки занимают пятое и шестое место в общей статистике онкологических заболеваний. Суммарно, опухоли толстой и прямой кишки занимают второе место, уступая лишь раку легкого. Хирургия остается оптимальным методом лечения, поскольку диагностирование опухоли преимущественно на поздних стадиях заболевания требует оперативных и радикальных мер помощи пациенту в короткие сроки. Тем не менее, современные методы химиотерапии, направленные на уменьшение размеров опухоли, замедление опухолевого роста и предотвращение появления новых метастазов, не менее важны при лечении КРР.

Применение таргетных препаратов нового поколения, таких как моноклональные антитела к EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor - рецептор эпидермального фактора роста) позволило увеличить общую выживаемость пациентов с метастатическим КРР при наличии у них дикого типа гена KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue). Ген KRAS служит одним из звеньев сигнального пути EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK, регулирующего клеточную пролиферацию, ангиогенез, апоптоз и др. В случае КРР наиболее часто проявляются мутации гена KRAS в 12 и 13 кодонах, однако мутации в 61, 117 и 146 кодонах (менее 1%) также оказывают постоянный активирующий эффект на активность RAS белка. Результатом возникающей независимо от состояния EGFR постоянной активации сигнального пути EGFR-KRAS-BRAF-MEK-MAPK является нейтрализация эффекта блокирующих EGFR таргетных препаратов [2, 4, 10].

Изучению частоты мутаций гена KRAS и их связь с клининико-патологическими особенностями у пациентов с колоректальным раком были посвящены многочисленные исследования [1]. На Юге России подобные исследования ранее не проводились. Вместе с тем, население данной территории имеет свои популяционные особенности, что требует подробного изучения.

Цель исследования заключалась в изучении популяционного полиморфизма 7 SNP-мутаций соматического происхождения в гене KRAS опухолевых биоптатов пациентов с диагнозом КРР Юга России для адекватного назначения таргетных препаратов (цетуксимаб, панитумумаб). Определялась взаимосвязь обнаруженных мутаций с клинико-патологическими особенностями пациентов, получавших стационарное лечение в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Пациенты и методы

В настоящее исследование было включено 168 пациентов (73 мужчины, 95 женщин) в возрасте от 28 до 89 лет с морфологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы толстой или прямой кишки. Из фиксированных в 10%-м забуференном формалине и залитых в парафин образцов тканей опухолей получали срезы толщиной 8-10 мкм. Для молекулярно-генетического исследования использовали срезы, содержащие не менее 20% опухолевых клеток. Процедура экстракции ДНК включала в себя стандартную депарафинизацию срезов орто-ксилолом, отмывку 96-% этанолом, инкубирование при комнатной температуре в лизирующем буфере с протеиназой K в течение 12 часов и последующую инкубацию при температуре 900 в течение 1 часа. Затем образцы обрабатывали набором реагентов QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенной из образцов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Концентрация ДНК нормализовывалась до величины 1 нг/мкл. При помощи набора реагентов «Real-Time-PCR-KRAS-7M» («Биолинк», Россия) проводили определение 7 SNP-мутаций (Single Nucleotide Polymorphism) в 12 и 13 кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США).

Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2010 и STATISTICA 8.0. Определяли различия в группах, выделенных в соответствии с определенными признаками (пол, возраст, локализация первичной опухоли, степень дифференцировки опухолевых клеток, наличие метастазов в печень, регионарные и отдаленные лимфоузлы, стадия заболевания), у пациентов с мутантным и диким типом гена KRAS. Оценку различий проводили с использованием χ2-критерия, для уровня статистической значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Согласно данным клинических экспериментальных исследований, соматические мутации гена KRAS в опухолях толстого кишечника различных популяций очень вариабельны и встречаются от 30 до 60% случаев [1, 9]. Например, у афроамериканцев частота мутаций в гене KRAS составила 30,9% (n=222), у японцев – 37,6% (n=5790), у немцев – 49% (n=820), у итальянцев – 38,4% (n=107), у корейцев – 35,4% (n=82) соответственно. В исследованной нами группе пациентов c КРР I-IV стадии (n=168) мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS были обнаружены в 38,7% (n=65) случаев.

В ряде исследований, анализировавших связь между такими клинико-патологическими особенностями, как возраст, пол, локализация опухоли, глубина инвазии, наличие регионарных, или отдаленных метастазов, степень злокачественности, инвазия в сосудистое русло, размер опухоли статистически значимых отличий в проявлениях мутантного или дикого типов гена KRAS не было обнаружено [3]. Однако имеются данные о том, что мутантный ген KRAS чаще встречается в опухолях ректосигмоидного отдела и прямой кишки, чем в вышележащих отделах. [1]. Ассоциации между мутациями гена KRAS и различными клинико-патологическими особенностями пациентов представлены во многих исследованиях. Результаты проведенного нами исследования на Юге России свидетельствует о статистически значимой более высокой частоте проявления мутаций в гене KRAS при КРР у женщин по сравнению с мужчинами, а также более высокий уровень мутаций в гене KRAS при наличии метастазов в регионарные лимфоузлы (p<0,05). Кроме того, близки к статистически значимым различия в группах пациентов старшего возраста и с поздними стадиями заболевания (табл.1). Статистически значимых ассоциаций наличия мутантного типа гена KRAS в группах пациентов в зависимости от локализации первичной опухоли, степени дифференцировки опухолевых клеток, наличия метастазов печень и отдаленные лимфоузлы в данном исследовании не обнаружено. Тем не менее, в некоторых работах присутствуют данные о взаимосвязи между мутациями KRAS и клинико-морфологическими признаками.

Таблица 1

Ассоциация наличия мутаций в гене KRAS и клинико-патологических характеристик пациентов с колоректальным раком (КРР)

Характеристика

Общее число пациентов,

n=168 (%)

Статус гена KRAS

Значение

критерия χ2

Значение p,

статистическая значимость

p<0,05

Дикий тип,

n=103 (61,3%)

Мутантный тип,

n=65 (38,7%)

Пол

Мужчины

73 (43,5%)

51 (69,8%)

22 (30,2%)

3,98

0,046

значимо

Женщины

95 (56,5%)

52 (54,7%)

43 (45,3%)

Возраст

≤ 55 лет

59 (35,1%)

42 (71,2%)

17 (28,8%)

3,74

0,053

не значимо

> 55лет

109 (64,9%)

61 (55,9%)

48 (44,1%)

Локализация первичной опухоли

Проксимальные отделы ТК

50 (29,7%)

30 (60%)

20 (40%)

0,05

0,8205

не значимо

Дистальные

отделы ТК, в т.ч. прямая кишка

118 (70,3%)

73 (61,8%)

45 (38,2%)

Дифференцировка опухолевых клеток*

G2

143 (85,1%)

87 (60,8%)

56 (39,2%)

0,09

0,7647

не значимо

G3

25 (14,9%)

16 (64%)

9 (36%)

Метастазы в печень

Есть

77 (45,8%)

47 (61%)

30 (39%)

0,01

0,8939

не значимо

Нет

91 (54,2%)

56 (61,5%)

35 (38,5%)

Метастазы в регионарные лимфоузлы

Есть

74 (44%)

43 (58,1%)

31 (41,9%)

1,48

0,046

значимо

Нет

60 (56%)

41 (68,3%)

19 (31,7%)

Метастазы в отдаленные лимфоузлы

Есть

40 (23,8%)

25 (62,5%)

15 (37,5%)

0,03

0,8594

не значимо

Нет

128 (76,2%)

78 (60,9%)

50 (39,1%)

Стадия

I+II

33 (19,6%)

25 (75,7%)

8 (24,3%)

3,61

0,0573

не значимо

III+IV

135 (80,4%)

78 (57,7%)

57 (42,3%)

*В настоящем исследовании опухоли высокой степени дифференцировки (G1) не наблюдались.

Так, в популяциях пациентов с КРР раком в Швейцарии (n=404) и Турции (n=53) ассоциаций с возрастом, полом и дифференцировкой опухолевых клеток не выявлено, но показана связь между мутациями 13 кодона гена KRAS и стадиями развития заболевания по классификации Дьюка. Согласно другим данным, в том числе и нашего исследования, имеется связь мутаций гена KRAS с полом и наличием регионарных метастазов [7, 8, 9].

В проведенном исследовании в опухолях с мутантным типом гена KRAS (n=65) преобладающим типом мутаций оказались транзиции (69,2%), т.е. замены по типу «пуриновое основание на пуриновое» или «пиримидиновое основание на пиримидиновое», а на долю трансверсий пришлось соответственно 30,8%. (рис.1, табл. 2). Среди SNP-мутаций в 12 и 13 кодонах в обследованной группе наиболее часто встречались - G12D (32,7%) и G13D (24,7%).

missing image file

Рис.1. Частота различных мутаций в гене KRAS (12, 13 кодоны) у пациентов с КРР

на Юге России

Таблица 2

Анализируемые SNP-мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS

Мутация

Тип

Результирующая замена аминокислоты

G12C

Транзиция

глицин→цистеин

G12A

Трансверсия

глицин→аланин

G12S

Транзиция

глицин→серин

G12R

Трансверсия

глицин→аргинин

G12V

Трансверсия

глицин→валин

G12D

Транзиция

глицин→аспарагиновая кислота

G13D

Транзиция

глицин→аспарагиновая кислота

Результатами многих исследований показано, что наиболее часто встречающимися SNP-мутациями при КРР являются транзиции (мутации G12D и G13D) с результирующей заменой глицина на аспарагиновую кислоту в белковой последовательности [3]. Среди пациентов с КРР на Юге России мутации G12D и G13D также встречаются чаще других мутаций (рис.1). Известно, что транзиции могут происходить спонтанно в результате ошибок репликации ДНК под действием пищевых генотоксических агентов и химических модификаций азотистых оснований . Также имеются сведения о влиянии профессиональных вредностей и курения на возникновение мутаций в 13-го кодоне гена KRAS [5].

Заключение

В проведенном исследовании впервые определена частота мутаций гена KRAS у пациентов с КРР на Юге России (38,7%), которая близка по своему значению к среднеевропейской (~40%). Больные с КРР нуждаются в определении статуса мутаций гена KRAS, играющего важную роль в плане дальнейшей стратегии химиотерапевтического лечения. Так, например, при наличии мутации в 13 кодоне возможно эффективное сочетанное применение традиционной химиотерапии с таргетными препаратами. В проведенном нами исследовании частота мутаций G13D составляет практически четвертую часть среди всех анализируемых изменений. Данная группа пациентов потенциально может получать таргетную терапию в сочетании с традиционной химиотерапией [9]. Выявленные ассоциации мутаций гена KRAS c клинико-патологическими особенностями позволяют с большей вероятностью ожидать мутации гена KRAS у женщин и при наличии регионарного метастазирования в лимфатические узлы. Также очень высока вероятность обнаружения мутаций в гене KRAS (12, 13 кодоны) у пациентов старше 55 лет (более чем на 50%) и на 3-4 стадиях развития онкологического процесса (более чем на 75%). Проведение молекулярно-генетического исследования среди пациентов с КРР позволило более полно охарактеризовать популяцию, проживающую на Юге России по частотам различных видов SNP-мутаций гена KRAS.


Библиографическая ссылка

Водолажский Д.И.,1Антонец А.В., Двадненко К.В., Владимирова Л.Ю., Геворкян Ю.А., Касаткин В.Ф., Максимов А.Ю. СВЯЗЬ МУТАЦИЙ ГЕНА KRAS С КЛИНИКО-ПАТОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА У ПАЦИЕНТОВ ЮГА РОССИИ // Международный журнал экспериментального образования. – 2014. – № 1-1. – С. 65-68;
URL: https://expeducation.ru/ru/article/view?id=4517 (дата обращения: 28.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074