Научный журнал
Международный журнал экспериментального образования

ISSN 2618–7159
ИФ РИНЦ = 0,757

РОЛЬ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ РАСТЕНИЙ В БИОТРАНСФОРМАЦИИ АТРАЗИНА, ПРОПАЗИНА И СИМАЗИНА

Бозшатаева Г.Т. 1 Оспанова Г.С. 1 Турабаева Г.К. 1 Мынбаева Р.О. 1
1 Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауэзова
В статье приведены результаты исследования по изучению возможного биохимического механизма растительной биотрансформации триазинов в мутагены. Используя ингибиторы и индукторы растительной пероксидазы и цитохромов, показано, что мутагенная активация исследованных триазинов не протекает по пероксидазному механизму, а осушествляется в ходе микросомального окисения. Это продемонстрировано в экспериментах с использованием гомогенатов из обработанных индукторами растений.
биотрансформация
растительные промутагены
микросомальные монооксигеназы.
1. Бозшатаева Г.Т., Савицкая И.С., Мухитдинов А.С., Шигаева М.Х. Метаболическая активация триазиновых гербицидов гомогенатами растений // Вестник КазГУ. Сер. биол. – 2003. – №4. – С.78-81.
2. Ваганов П.А. Как рассчитать риск угрозы здоровью из-за загрязнения окружающей среды: задачи с решениями. – СПб.: Изд-во СПбГУ, 2012. – 128с.
3. Кесельман M.JI. Свободнорадикальные механизмы пестицидной интоксикации в эколого-гигиенических исследованиях. – М., 2007. – 298 с.
4. Фонштейн JI.M., Калинина Л.М., Полухина Г.Н., Абилев С.К., Шапиро A.A. Тест-система оценки загрязнителей среды на S. Typhimurium: методическое указание. – М.: ВИНИТИ, 1997. – 52 с.

Введение

Среди различных классов химических соединений, применяемых в современном сельском хозяйстве и лесоводстве, наиболее отрицательным сопутствующим действием обладают, пестициды [2].

К настоящему времени накоплен значительный фактический материал, показывающий, что многие пестициды действуют непосредственно на наследственные структуры, вызывая их стойкие изменения, мутации [3].

Триазиновые гербициды используются в сельскохозяйственной практике для защиты зерновых, овощных культур и виноградников от сорных растений. Они весьма разнообразны как по химической природе, так и по генотоксичности. Изучение мутагенной активности на про- и эукариотных организмах показало, что среди триазиновых гербицидов обнаруживаются прямые мутагены и промутагены, генотоксичность которых регистрируется только с помощью растительных и животных клеток.

Для определения мутагенного действия пестицидов применяют различные тест-объекты: микроорганизмы, растения, насекомые, млекопитающие. 71% изученных пестицидов проявили мутагенную активность в бактериальных тестах с метаболической активацией и без нее.

Растения непосредственно контактируют с мутагенами среды, адсорбируя их на поверхности и подземных органах или поглощая через корни. Дальнейшая судьба ксенобиотиков зависит от направленности ферментативных превращений в клетках и тканях растений. Известно, что некоторые мутагены подвергаются активации или дезактивации.

К настоящему времени известно, что биотрансформация пестицидов в растениях может осуществляться при помощи двух разных ферментных систем – микросомальными монооксигеназами, преимущественно ферментами цитохрома Р-450 и пероксидазами, осуществляющими 1-электронное окисление.

Цель исследования: изучение механизмов метаболической трансформации триазиновых гербицидов под влиянием ферментных систем растений в мутагены.

Материал и методы исследования

В работе были использованы индикаторные системы: индикаторные штаммы: Salmonella typhimurium: ТА-98 his D3052, rfa, uvr B, pKM 101; TA 100- his G46, rfa uvr B pKM 101; семена ячменя Hordeum vulgare L. сорта Черниговский-5.

При выполнении работ использовались следующие методы:

1. полуколичественный метод учета генных мутации у индикаторных бактерий S. typhimurium. Использовали чашечный тест Эймса. Мутагенный эффект учитывался по кратности превышения числа ревертантов, индуцированных препаратами, над спонтанным фоном [4];

2. приготовление растительной активирующей смеси. Проростки ячменя выращивали в течение 5 суток в лабораторных условиях с естественной фотопериодичностью, затем растения собирали, измельчали и замораживали. Растительный материал гомогенизировали в ступке, добавляя двойной объем фосфатного буфера (рН 7,4), и центрифугировали 15 минут при режиме 9000g и температуре 2-4оС. Супернатантную жидкость отбирали и сразу использовали в опыте. В экспериментах использовали полную активирующую смесь (ПАС) и неполную активирующую смесь (НАС). В состав ПАС входили: исследуемый препарат, суспензия бактерий, растительный гомогенат и кофакторы, необходимые для работы окислительно-восстановительных ферментов. В вариантах с НАС вместо кофакторов вносили соответствующий объем растворителя – воды;

3. полуколичественный учет генных мутации с активацией препаратов ферментными системами растений в условиях in vivo. Проростки растений в течение двух недель обрабатывали различными концентрациями триазиновых гербицидов, затем из этих растений готовили гомогенат и на индикаторных бактериях определяли их мутагенную активность.

Результаты исследования и их обсуждение

Об участии тех или иных ферментов, осуществляющих мутагенную активацию пестицидов, можно судить по результатам экспериментов, в которых используются ингибиторы, или наоборот, индукторы энзимов. Этот подход мы использовали для выяснения возможных биохимических особенностей активации промутагенных триазиновых гербицидов атразина, пропазина и симазина.

В качестве ингибитора пероксидаз использовали диэтилдитиокарбамат (ДЭДК), а ингибитора цитохромного комплекса – метирапон. Микросомными индукторами служили – совол, фенобарбитал и 2,4-дихлоруксусная кислота (2,4-Д).

Растворами ДЭДК в концентрации 100, 250 и 500 мМ обрабатывали растения ячменя в течение всего времени их роста. Из обработанных проростков готовили микросомальные супернатанты, в которых определяли активность пероксидазы. ДЭДК в дозе 500 мМ почти полностью подавлял пероксидазную активность, поэтому в экспериментах по определению роли пероксидазы в мутагенной активации триазинов использовали гомогенаты растений, обработанные ДЭДК в концентрации 250мМ, в которых активность пероксидазы снижалась на 50-70%.

Активирующую способность гомогенатов оценивали по уровню мутагенного эффекта, индуцированного пропазином, симазином и атразином у индикаторного штамма S.typhimurium TA98. В экспериментах использованием ДЭДК не наблюдалось статистически значимого снижения регистрируемого эффекта, что свидетельствует о несущественной роли пероксидазы в мутагенной активации триазиновых гербицидов.

Другим ферментом, принимающим участие в метаболизме ксенобиотиков в растениях, является цитохром Р-450. Для выявления роли микросомальных монооксигеназ в мутагенной активации триазинов приведены три варианта экспериментов. Во-первых, определяли участие кофакторов в метаболической активации триазинов, что служит косвенным указанием на участие этой системы микросомального окисления трансформации триазинов. Во-вторых, изучали влияние ингибиторов и индукторов монооксигеназ на активность цитохромов Р-450 в гомогенатах ячменя в условиях in vivo и in vitro. В третьих, исследовали влияние индукторов и ингибиторов микросом на трансформацию промутагенов в мутагены.

Для активации триазинов наличие кофакторов в активирующей смеси является существенным – в этом случае число ревертантов, индуцированных пропазином в 2,1-2,5, симазином в 1,9-2,5, атразином в 1,7-2,1 раза выше, чем в вариантах с неполной активирующей смесью. Влияние кофакторов, обеспечивающих более эффективное функционирование системы микросомального окисления на мутагенную активацию триазинов, косвенно указывает на участие этой системы в их трансформации в мутагены.

Для подтверждения этого предположения провели эксперименты с индукторами и ингибиторами микросомальных монооксигеназ. В качестве маркерной реакции на активность цитохрома Р-450 у растений использовали реакцию гидроксилирования коричной кислоты, которую измеряли по изменению интенсивности окраски.

Метирапон, являясь эффективным ингибитором растительных цитохромов Р-450, в дозе 25мМ на 40% и дозе 50мМ, на 70% снижал уровень активности цитохромов в гомогенатах растений. Из индукторов цитохрома Р-450 наиболее эффективное действие оказывал 2,4 Д, коэффициент индукции в дозе 200мМ составлял 3,2.

Из обработанных индукторами и ингибиторами (метирапон – 50мМ, совол – 100мМ, фенобарбитал, 2,4Д – 200мМ) гомогенатов растений готовили микросомальные супернатанты с целью выявления их роли в активации триазинов (таблица).

Таблица

Влияние индукторов и ингибиторов на растительную активацию пропазина, атразина и симазина

Препарат

Концен-

трация

мг/мл

Количество ревертантов на чашку

-S9

+S9

S9

совол

Фенобар

битал

2,4Д

Метирапон

Пропазин

10

32±1,6

390±21,0

452±26,0

610±35,0

1716±100,0

70±3,9

1

23±1,2

312±18,0

390±22,0

446±27,0

23±1,2

58±3,5

0,1

17±0,9

170±10,0

231±14,0

351±21,0

17±0,9

34±1,8

контроль

21±1,0

26±1,3

32±1,8

36±1,9

21±1,0

30±1,6

Атразин

10

24±1,3

172±11,0

361±20,0

550±33,0

600±40,0

43±2,2

1

18±0,9

146±8,3

310±18,0

503±27,0

510±31,0

30±1,6

0,1

17±1,0

131±7,7

225±13,0

390±23,0

415±24,0

22±1,1

контроль

17±0,9

22±1,2

21±1,0

36±1,9

30±1,6

20±1,0

Симазин

10

26±1,5

212±11,0

394±23,0

482±29,0

623±38,0

30±1,6

1

21±1,1

165±8,7

341±19,0

395±23,0

609±35,0

27±1,5

0,1

19±1,1

145±8,8

236±13,0

260±15,0

500±31,0

24±1,4

контроль

17±1,0

22±1,2

30±1,6

32±1,7

32±1,6

20±1,0

Метирапон почти полностью подавлял активацию атразина, симазина и пропазина. Наблюдалось снижение мутагенной активности пропазина в 5-5,6, симазина в 6-7, атразина в 4-6 раза по сравнению с контролем. Увеличение микросомальной активности растительных гомогенатов приводило соответственно к возрастанию мутагенного эффекта всех трех препаратов. Наиболее эффективным микросомальным индуктором оказался 2,4Д, мутагенная активность пропазина – активированного гомогенатом, индуцированным 2,4Д в 4,4, атразина в 4, симазина в 4,1 раза превосходила таковую без индукции.

Известно, что трансформация пестицидов в растениях осуществляется как микросомальными монооксигеназами, преимущественно ферментами цитохрома Р-450, вызывающими гидроксилирование, эпоксидирование и дезалкилирование, так и 1-электронным окислением, индуцируемым пероксидазой.

Нами впервые изучен возможный биохимический механизм растительной биотрансформации триазинов в мутагены. Используя ингибиторы и индукторы растительной пероксидазы и цитохромов, нам удалось показать, что мутагенная активация исследованных триазинов не протекает по пероксидазному механизму, а осушествляется в ходе микросомального окисения. Это особенно наглядно продемонстрировано в экспериментах с использованием гомогенатов из обработанных индукторами растений [1].

Для индуцирования растительных микросом используются различные агенты Fe 3+ , Mn 2+ ионы, свет, гербициды, этанол, инкубирование в воде. Нами впервые была предпринята попытка индуцировать микросомы с помощью фенобарбитала, совола и 2,4Д, обычно применяемые для индукции микросом печени. Наибольшее усиление мутагенного эффекта триазинов отмечено в присутствии фракции S9 ячменя, предварительно обработанного 2,4 Д, что коррелирует с увеличением активности цитохрома Р-450 в растениях, обработанных индукторами. Это позволяет рекомендовать 2,4 Д в качестве наиболее эффективного индуктора растительных микросомальных монооксигеназ.

Выводы

По результатам проведенных исследовании были сделаны следующие выводы:

1. Ингибитор пероксидазы ДЭДК не влияет или слабо влияет на мутагенную активность триазинов, т.е. пероксидазы не играют существенный роли в биотрансформации промутагенных триазинов;

2. В биотрансформации промутагенов в мутагены участвуют микросомальные монооксигеназы.


Библиографическая ссылка

Бозшатаева Г.Т., Оспанова Г.С., Турабаева Г.К., Мынбаева Р.О. РОЛЬ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ РАСТЕНИЙ В БИОТРАНСФОРМАЦИИ АТРАЗИНА, ПРОПАЗИНА И СИМАЗИНА // Международный журнал экспериментального образования. – 2014. – № 3-1. – С. 58-60;
URL: http://expeducation.ru/ru/article/view?id=4662 (дата обращения: 21.06.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074