Научный журнал
Международный журнал экспериментального образования
ISSN 2618–7159
ИФ РИНЦ = 0,839

РОЛЬ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ЖЕЛЕЗА И СЕРЫ В МЕЖВИДОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ

Павлов В.А. 1 Котомцев В.В. 1, 2 Медвинский И.Д. 1 Кравченко М.А. 1 Сабадаш Е.В. 1
1 ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Минздрава РФ»
2 ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии УО РАН»
С давних пор известно антимикробное действие оксидов серы, в том числе и на микобактерии туберкулеза. Но как может реализоваться такой эффект in vivo не известно. В наших исследованиях установлено, что крысы (устойчивые к туберкулезу животные) имеют в тканях гораздо большие количества сульфата и сульфита (в виде таурина), чем морские свинки, высокочувствительные к туберкулезу. У крыс, после заражения микобактериями туберкулеза, этих метаболитов становится еще больше, а у морских свинок – меньше. Высокие концентрации окисленной серы в тканях препятствуют снижению количества железа в тканях зараженных животных и повышают их устойчивость к микобактериям туберкулеза, за счет стимуляции образования в костном мозге предшественников макрофагов-моноцитов и лучшего обеспечения эритроцитов гемоглобином.
экспериментальный туберкулез
морские свинки и крысы
разная чувствительность к микобактериям туберкулеза
метаболизм железа и серы
1. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П.П. Голиков. – М.: «Медпрактика», 2004. – 214 с.
2. Павлов В.А. Механизмы повреждения и адаптации в организме при экспериментальном тукберкулезе в условиях действия ароматических ксенобиотиков: дис…. докт. мед. наук. – Екатеринбург. – 2000. – 318 с.
3. Праскуряков С.Я. Некроз – активная управляемая форма программируемой клеточной гибели / С.Я. Проскуряков, В.Л. Габай, А.Г. Коноплянников // Биохимия. – 2002. Том 67. – Вып.4. – С.457-491.
4. Пузик В.И. Проблемы иммуноморфологии туберкулеза / В.И. Пузик. – М.: Медицина. – 1966. – 185с.
5. Сабадаш Е.В. Экспериментальное обоснование применения таурина в терапии туберкулеза / Е.В. Сабадаш: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – Екатеринбург, 2006. – 26 с.
6. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Норкин М.Н. и др. Участие оксида азота в развитии инфекционного процесса /Л.В. Сахно, О.Ю. Леплина, М.Н. Норкин / /Бюл.экспериментальной медицины. – 2000. – Т.45, № 10. – С.12-14.
7. Gilka M/ The oxidative hypothesis of senescence / M. Gilka, I. Stoian, V. Atanasin, B. Virgolici // J. Postgrad. Med. – 2007. – Voi.53. – P.207-213.
8. Guerra C. Control of Mycobacterium tuberculosis growth by glutathioneen hanced natural killer cells / C. Guerra, K. Johal, D. Morris // Clin.and.Immun. – 1012. – Vol.168. – №1. – P. 148-152.
9. .GrimbleF.R. The effects of sulfur amino acid intake on immune function in human s/ F.R. Grimble // J. Nutr. -2006. – Vol. 136. – №6. – P.1660-1665.
10. Olinto S.C.F. Arginine induces GH gene expression dy activating NOS/NO signaling in rat isolated hemi-pituitaries / S.C.F. Olinto , M.G. Adrino, T. Castro- Barbosa // Braz. J. Med. Biol. Res. – 2012. – Vol.45. – №11. – P.1066–1073.

Механизмы естественной устойчивости к туберкулезу остаются во многом не понятны, что не позволяет разработать эффективные средства патогенетической терапии. Особенно это актуально для туберкулеза с лекарственной устойчивостью, при сочетании туберкулеза и ВИЧ инфекции, других тяжелых сопутствующих заболеваниях. Тяжелая туберкулезная инфекция сопряжена с прогрессирующим нарастанием свободнорадикальных процессов в пораженных специфическим процессом тканях, чему способствуют нарушения обмена железа и серы, что отмечалось еще в 50–60-х годах прошлого века [3,4]. Но как воздействовать на эти нарушения и в настоящее время во многом не понятно.

Целью наших исследований было сопоставить защитные механизмы с участием железа и серы в тканях устойчивых и чувствительных к туберкулезу животных.

Материалы и методы исследования

Опыты проводились на устойчивых к микобактериям туберкулёза (МБТ) крысах, и высокочувствительных к МБТ морских свинках. Животные были взяты из питомника Уральского НИИ фтизиопульмонологии, которые содержались в стандартных условиях вивария согласно принятым требованиям. План эксперимента был рассмотрен и утверждён биоэтической комиссией УНИИФ. Всего в исследованиях было 20 морских свинок (10 опытных и 10 контрольных) и 20 крыс (10 опытных и 10 контрольных) массой 200 – 250 гр. В возрасте 2 – 3 месяца. План эксперимента был рассмотрен и утвержден биоэтической комиссией УНИИФ. Для воспроизведения экспериментального туберкулеза использовали музейный штамм микобактерий Центрального НИИ туберкулеза Н37Rv (1993 г.). Морские свинки заражались в паховую складку в дозе 0,001 мг, крысы дозой 0,1 мг 2-недельной живой культурой. Выведение из эксперимента производилось через 6 недель после заражения при развитии у морских свинок генерализованного туберкулеза.

Для определения исследуемых показателей у животных под наркозом забирали кровь из сердца. В крови исследовали содержание гемоглобина общепринятым методом.

Костный мозг получали из бедренных костей. Готовили мазки, которые окрашивали по Поппенгейму. Клеточность костного мозга определяли на гемоцитометре.

Общее количество железа в исследуемой ткани определяли при помощи атомно-абсорбционного спектрофотометра «Спираль-14» после минерализации ткани при 450 градусах С.

Сульфатную серу в биологическом материале определяли спектрофотометрически с использованием барий- желатинового реактива.

Для биохимических исследований были заморожены образцы сыворотки крови и лейкоцитарной взвеси.

При помощи иммуноферментного анализатора в плазме крови и лейкоцитах исследовали уровень суммарных перекисей липидов (по показателям OXYSTATA производства BiomedicaGRUPPE) и стабильных производных (нитрата) оксида азота (RandDSystems). При помощи газожидкостной хроматографии на анализаторе ААА 339М «Микротехника» после замораживания тканей в жидком азоте определяли количество свободных аминокислот и глутатиона восстановленного и окисленного, полиаминов.

Для статистической обработки данных использовали непараметрические методы с обработкой полученных данных в программе Excel. Оценка степени достоверности различий между группами оценивалась по критерию «U» Манна–Уитни.

Работа выполнена согласно темам НИОКР УНИИФ Минздрава РФ № 114032140001 и 01201352042 ИИФ УО РАН.

Результаты исследования и их обсуждение

На момент выведения из эксперимента у всех зараженных морских свинок развивался генерализованный туберкулез с преимущественным поражением селезенки, печени, лимфоузлов, легких. У крыс, не смотря на то, что доза заражения была в 100 раз большей, туберкулезный процесс не развивался.

Исследование крови подопытных животных показало, что у морских свинок генерализация туберкулезного процесса сопряжена с развитием железодефицитной анемии. Так, если в норме гемоглобин в крови морских свинок составлял 149г/л, то через 6 недель после заражения он был равен 78г/л (2-кратное снижение (р <0,01). У крыс уровень гемоглобина был 164 г/л и существенно не менялся после введения им МБТ. На этом фоне в органах менялось содержание железа в тканях. В легком, печени, селезенке, костном мозге морских свинок его количество уменьшалось в 2-3 раза (р< 0,01 во всех случаях). У крыс существенное уменьшение количества железа было только в селезенке- почти в 2 раза (р< 0,01). Важнейшим патогенетическим механизмом противостояния МБТ и макроорганизма является борьба за железо. Так, как ион железа необходим для биосинтеза супероксиддисмутазы (СОД) – ключевого фермента МБТ по защите ее от агрессивных радикалов кислорода генерируемых фагоцитами хозяина [3]. Как видим более эффективно это удается крысе, чем морской свинке, хотя и у крысы имеет место отчетливое снижение его количества в селезенке (табл. 1).

Таблица 1

Содержание железа в тканях морских свинок и крыс после заражения МБТ

Ткани животных в которых определялось количество железа (в мкг/г сырого веса ткани)

Группы животных

Интактные морские свинки,

n = 10

Зараженные МБТ морские свинки,

n = 10

Интактные крысы,

n = 10

Зараженные МБТ крысы,

n = 10

Легкое

140,4±16,9

(80,6–181,3)

91,5±10,2

(53,6–115,1)*

88,7±10,0

(46,4–121,8)

114,1±24,8

(57,2–206,9)

Печень

143,3±21,8

(68,2–206,5)

66,5±7,1

( 47,7–95,2)*

62,7±8,2

( 33,6–81,3)

62,6±7,5

(40,1–95,3)

Селезёнка

257,6±22,6

(164,8-346,3)

90,8±8,2

(62,5-113,8)*

129,5±28,4 (38,6- 188,2)

70,6±22,5

(20,9–180,1)*

Костный мозг

364,2±42,1

(196,8–441,4)

164,5±36,

5(89,8–298,6)*

280,4±31,5 (105,7–376,8)

216,5±37,1

(128,6–365,4)

* – достоверно отличающиеся от контроля результаты, (Р <0,01).

То есть, в любом случае, МБТ влияет на метаболизм железа в организме устойчивых и восприимчивых к туберкулезу животных, но в разной степени. Считается, что защита иона железа от использования его МБТ осуществляется его нитрованием оксидом азота [1].

Нами установлено, что у животных с различной видовой устойчивостью к МБТ генерация высокоактивных соединений азота (ВСА) в организме в ответ на заражение музейным штаммом МБТ – Н37 Rv значительно отличается. Так, у морских свинок количество конечного продукта окисления ВСА – нитрата в плазме крови возрастает после заражения от 56, ±11,2 мкмоль/л в контроле, до 88,8 ±10,5 мкмоль/л, то есть примерно в 1,6 раза (р < 0,01 к контролю). Тогда, как у крыс достоверного увеличения этого вещества к контролю не наблюдается (26,14 – 31,9 мкмоль/л, соответственно). Следует отметить, что морские свинки располагают большими ресурсами ВСА, о чём говорит 2х-кратное превосходство нитрата в плазме крови этих животных по сравнению с крысами (р <0,01).

Обращает на себя внимание, что у морских свинок так же гораздо более высокие показатели суммарных перекисей липидов определяемых по оксистату. Их содержание в крови у здоровых морских свинок 394,46 ±54,8 мкмоль/л., у зараженных – 609,53±143,40 (р< 0,01). У крыс его содержание 145,4±31,6 – 163,8 ± 18,8 мкмоль/л, соответственно, то есть, изменений после заражения практически не наблюдается (р> 0,05). Разница между морскими свинками и крысами по уровню суммарных перекисей в крови контрольных групп животных составила в 2 раза (р< 0,01). Но, после заражения МБТ, это различие становится почти 4х кратным. При чем у крыс увеличения показателей оксистата практически не наблюдается, а у морских свинок его уровень резко возрастает почти в 2 раза (p<0,01).

Нитрат является конечным метаболитом ВСА генерируемых эндотелием, фагоцитами, а оксистат – показатель конечных метаболитов превращения свободных радикалов кислорода – перекисей липидов. Эти метаболиты могут выполнять как регуляторно- защитную функцию, так и оказывать повреждающее воздействие на мембраны клеток и ткани при их высоких концентрациях в организме, например, при оксидативном стрессе [1].

Имеются данные, что при большом количестве ионов железа в тканях и низком уровне гидроперекисей в них железо выполняет антиоксидантные функции и наоборот- при низком уровне ионов железа и большом количестве гидроперекисей – прооксидантные [6,7]. Таким образом, замыкается порочный круг и МБТ навязывают необходимый им ритм метаболических процессов в макроорганизме, используя при этом его метаболические ресурсы. В частности большое количество железа для биосинтеза, например, антиоксидантного белка-фермента – бактериальной СОД [1,3].

В ферментных системах как макро- так и микроорганизмов железо входит в железо- серные комплексы. Поэтому острая борьба между МБТ и организмами подопытных животных разворачивается и за серу. Имеются данные, что у больных туберкулезом людей по мере прогрессирования заболевания с мочой начинает теряться все большее количество серосодержащих аминокислот [8]. Кроме того, есть данные что для МБТ необходимо большое количество тиолов (–SH групп), а вот окисленная сера (ионы SO3, SO4) для них неблагоприятна [2,9].

В наших исследованиях установлено, что после заражения количество сульфата (SO4) в печени морских свинок уменьшается почти в 2 раза с 498,8 мкг/г до 261, 9мкг/г (Р <0,01), а у крыс его количество было изначально больше, чем у морских свинок и после заражения еще увеличивается с 1246,4±345,1 мкг/г до 1447,4±276,7 мкг/г (P>0,05). То же самое касается и иона SO3, который присутствует в организме в виде таурина (NH2–СН3–СН2–SO3). Количество таурина в печени крыс после введения им МБТ резко увеличивается (с 525,2±28,9 мкг/г до 1657,5±425,1 мкг/г Р< 0,01) очевидно вследствие его усиленного биосинтеза из цистеина. Следует отметить, что таурина много в тканях крыс, особенно в кроветворных и лимфоидных. Так, в костном мозге крыс содержание таурина составляет 5859,1±620,4 мкг/г а у морских свинок – 468,7±71,1 мкг/г; в селезенке у крыс – 6105,1±245,1 мкг/г, а у морских свинок 902,0±58,1 мкг/г. Разница, как видим, в обоих случаях составляет почти на порядок (Р< 0,01). В костном мозге заражение МБТ подопытных животных приводит к следующим изменениям. Уровень таурина у крыс изменятся мало, зато увеличивается количество аргинина почти в 3 раза (Р< 0,01) и метионина от 0 до 51,0 мкг/г. Таурин, аргинин и метионин – метаболиты стимулирующие функционально – метаболическую активность фагоцитов [2, 8, 9, 10] и как установлено в наших исследованиях при увеличении этих метаболитов в костном мозге – у крыс усиливается моноцитарный росток кроветворения (табл. 2).

Таблица 2

Содержание свободных аминокислот костного мозга морских свинок и крыс после заражения МБТ (мкг/г ткани)

Название аминокислоты

Группы животных

Интактные морские свинки, n = 10

Зараженные МБТ морские свинки, n = 10

Интактные крысы,

n = 10

Зараженные МБТ крысы, n = 10

Таурин

486,7±71,1 (345,7–735,6)

1280,4±326,5

(562,9–2546,8)*

5859,1±620,4

( 4031,0–9005,0)

4201,6±386,9

(3216,6–5472,8)

Метионин

0

0

«следы»

51,0±5,8(34,2–66,4)*

Глутаминовая кислота

625,0±64,1

( 416,2– 901,6)

941,4±90,7

(720,8–1628,4)*

1536,±226,8

(865,2–2154,0)

739,3±82,4

(485,1–1156,4)*

Глутамин

246,1±45,7

86,4–350,2)

216,9±50,3 (157,0–367,5)

497,3±48,7

(363,6–723,8)

274,7±30,1

(192,0–352,8)*

Аргинин

«следы»

0

121,5±26,5

(67,3–225,1)

316,6±41,2

(161,9–395,4)*

* – достоверно отличающиеся от контроля результаты, (Р<0,05).

Результаты наших исследований подтверждают гипотезу что, усиление функционально – метаболических возможностей фагоцитов, очевидно, и препятствует развитию туберкулезного процесса [3,6].

МБТ изгоняются из организма крыс через несколько месяцев после их введения без признаков специфического инфекционного процесса при усилении клеточного звена иммунитета [2,4].

Морские свинки так же пытаются после заражения МБТ увеличить количество таурина в костном мозге (увеличение почти в 3 раза) (Р <0,01), но это увеличение все равно далеко не дотягивает до того уровня что имеется у крыс. Кроме того морские свинки увеличивают в костном мозге уровень глутаминовой кислоты и аланина. Но эти метаболиты являются стимуляторами лимфоидного звена кроветворения [10], что очевидно неэффективно при туберкулезной инфекции. У крыс, напротив, количество глутамата и аланина в костном мозге уменьшается, что в целом свидетельствует о значительно более рациональных защитно- адаптивных перестройках в кроветворных органах и иммунной системе крыс после введения им МБТ, чем у морских свинок. Это положение подтверждается изменениями в ростках кроветворения подопытных животных (табл. 3).

У морских свинок происходит стимуляция гранулоцитарного ростка кроветворения тогда, как эритроцитарный, моноцитарный, лмфоцитарный подавляются (во всех случаях Р< 0,05). У крыс отмечается отчетливое стимулирование моноцитарного ростка. При этом гранулоцитарный и лимфоидный существенных изменений к контролю не проявляют. Обращает на себя внимание, что угнетается эритроцитарный росток кроветворения примерно на 30 % (Р< 0,05).

Таблица 3

Соотношение ростков кроветворения в костном мозге морских свинок и крыс после заражения МБТ ( в % к общему количеству клеток)

Ростки кроветворения

Группы животных

Интактные морские свинки, n = 10

Зараженные МБТ морские свинки, n = 10

Интактные крысы,

n = 10

Зараженные МБТ крысы, n = 10

Гранулоцитарный

55,2±4,8

(18,0–71,6)

70,8±3,6

(63,4–79,1)*

58,7±-5,6

(53,8–82,6)

64,3±7,4

(57,6–70,2)

Эритроцитарный

36,6±3,2

(19,5–44,8)

23,5±2,4

(13,8–28,3)*

20,5±2,4

(16,4–27,2)

14,3±0,8

(11,0–17,0)*

Моноцитарный

1,3±0,3

(0,2–2,0)

0,6±0,1

(0,2–0,8)*

1,0±0,1

(0,4–1,6)

2,5±0,3

(1,4–4,0)*

Лимфоцитарный

12,3±1,4

(7,3–18,0)

5,7±0,6

(3,0–8,8)*

19,0±1,8

(12,0–20,6)

16,5±1,4

(9,0–22,8)

* – достоверно отличающиеся от контроля (интактные животные) результаты (Р<0,05).

У крыс, как мы уже отмечали, после введения им МБТ специфический туберкулезный процесс не развивается, но, тем не менее, борьба с введенными микроорганизмами продолжается и наиболее остро она идет за ресурсы железа и серы. Крысы располагают гораздо большими ресурсами сульфата в отличие от морских свинок, они имеют более мощную грубоволокнистую соединительную ткань богатую сульфатом [4]. Как видим мобилизация окисленной серы в виде сульфита и сульфата в печени крыс препятствует значительному истощению железа в организме крыс после введения им МБТ. Но, в следствие борьбы с внедрившимися МБТ все же некоторое истощение этих ресурсов наблюдается и у крыс. В частности резкое снижение количества железа в селезенке (табл. 1) и некоторое угнетение образования эритроцитов (табл. 3). Но особенности метаболизма крыс позволяют им резко мобилизовать клеточно-фагоцитарное звено иммунитета и подавить МБТ с последующим их изгнанием из организма.

Ранее мы публиковали сведения о том, что крысы на введение МБТ усиливают биосинтез аскорбиновой кислоты (АК) и таурина в печени [4] с одновременным возрастанием уровня таурина, глутатиона восстановленного, аргинина, активных форм кислорода (АФК) в лейкоцитах и плазме крови. То есть, усиливается метаболическая активность фагоцитов, но их функциональная активность возрастает в меньшей степени. АК, глутатион восстановленный, аргинин и таурин мощные стабилизаторы мембран и антиоксиданты [1,7,8,9] что, очевидно, и позволяет резко усилить генерацию АФК в фагоцитах и уничтожить введенные МБТ на метаболическом уровне без существенного перенапряжения иммунной системы. У морских свинок после заражения отмечается угнетение фагоцитов крови, как на функциональном так и на метаболическом уровне [2,5]. В костном мозге угнетается эритроцитарный и моноцитарный ростки кроветворения усиливается гранулоцитарный. При этом, в кроветворной ткани увеличивается содержание глутаминовой кислоты и аланина. Показательно, что в костном мозге крыс после заражения общая сумма аминокислот уменьшается с 12042,6 мкг/г до 8377,5 мкг/г, тогда как у морских свинок увеличивается с 3066,3мкг/г до 4089,2 мкг/г. Уровень полиаминов возрастает у первых от 218,4 нмоль/г до 386,5 нмоль/г, а у вторых снижается с 186,4 нмоль/г до 98,5 нмоль/г (во всех перечисленных случаях различие достоверно – р <0,01). Отмеченные различия свидетельствуют о том, что в кроветворной ткани крыс усиливаются анаболические процессы, а у морских свинок катаболические.

Ранее мы отмечали, что в печени морских свинок после заражения МБТ содержание АК и таурина уменьшаются, но при этом усиливается образование глутатиона и происходит резкое его окисление [2]. Уровень окисленного глутатиона и оксида азота возрастает в плазме и лейкоцитах крови. Окисленный глутатион, аргинин и оксид азота – мощные стимуляторы апоптоза [ 3]. Очевидно, апоптоз является главной стратегией защиты морских свинок после заражения их МБТ, но это не спасает морскую свинку от генерализации туберкулезного процесса и скорой гибели, тогда как крысы обеспечивают эффективную перестройку защитно-адаптивных механизмов и изгоняют через несколько месяцев введенные МБТ из организма.

Заключение

Таким образом можно констатировать тот факт, что ионы железа, серы (сульфат и сульфит), аскорбиновая кислота, таурин, глутатион восстановленный , аргинин, метионин являются факторами повышающими естественную резистентность к туберкулезу в то время как стимуляторы апоптоза- глутатион окисленный, оксид азота, глутамат, аргинин повышают чувствительность организма к туберкулезной инфекции. Различные сочетания метаболитов, повышающих естественную резистентность к МБТ, могут быть использованы в патогенетической терапии туберкулеза.


Библиографическая ссылка

Павлов В.А., Котомцев В.В., Медвинский И.Д., Кравченко М.А., Сабадаш Е.В. РОЛЬ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ЖЕЛЕЗА И СЕРЫ В МЕЖВИДОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ // Международный журнал экспериментального образования. – 2016. – № 3-2. – С. 264-268;
URL: https://expeducation.ru/ru/article/view?id=9715 (дата обращения: 03.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074